[发明专利]一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用

权利要求书

1.一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至10⁷～10⁸个/mL，既得种子孢子液；

步骤二：以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤内酯醇衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；

步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；

步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，最后用100%乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；

步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤内酯醇衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤内酯醇衍生物。

2.如权利要求1所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：

所述的土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121℃灭菌30min，即得；斜面培养基为：取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121℃下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。