[发明专利]人HCRCN81蛋白与鼠抗人的单克隆抗体制备及用途

说明书

技术领域

本发明涉及人结直肠癌细胞所表达的一种天然蛋白与鼠抗人单克隆抗体的制备及用途。

背景技术

大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤第三位,在我国居消化道恶性肿瘤的第2位。早期缺乏特异性临床表现，就诊时50%-60%已属晚期，5年生存率低。2006年国家卫生部的统计数据显示，我国大肠癌死亡率已位居恶性肿瘤第五位，其发病率在40岁开始上升，至60-75岁时达到高峰。发病率呈逐年上升趋势。因此，早期诊断已成为大肠癌综合防治的重点。

开展对无症状人群普查是发现早期大肠癌的有效途径,目前，大肠癌的确诊主要依靠结肠镜和内镜病理细胞学检查。内镜检查不仅能直观地发现大肠粘膜早期病变，并且能借助活检对病变区域进行组织学评价。但是在活检标本中，腺体的不典型增生和腺体癌变不易区分，二者的根本区别是癌细胞的侵袭行为，但内镜活检取材组织小，有时早期癌只能观察到异型性而无癌细胞的侵袭表现。因此，肠镜+活检的诊断方式对于大肠癌的早期确诊还是存在一定的局限性。针对这种情况，科学家们开始寻找肿瘤分子标志物，希望能从分子水平上进行大肠癌的早期诊断.但至今为止，尚未发现特异性识别大肠癌的分子标志物。

单克隆抗体特异性强，能识别特异性的抗原表位，批次稳定，是临床应用于癌症分子病理诊断的有用的工具。我们制备了鼠抗人HCRCN81蛋白的单克隆抗体，实验表明鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)能够识别人癌细胞和人组织所表达的HCRCN81天然蛋白，可以作为结直肠癌及其它癌症的早期诊断试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种Balb/c小鼠的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，该细胞株可以产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，并证明所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)可用于检测人癌细胞内和人癌组织中的癌细胞内HCRCN81蛋白质的表达，为癌症的早期分子病理诊断提供有用的工具。

本发明所述人HCRCN81蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所述。

本发明所述鼠抗人单克隆抗体，由上述蛋白质免疫Balb/c小鼠后筛选纯化阳性P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，其制备方法依次包括以下步骤：

（1）通过RT-PCR反应，获得人HCRCN81蛋白质编码基因；

（2）将步骤（1）扩增的人HCRCN81蛋白质编码基因插入到原核载体构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

（3）利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析所述原核重组质粒，并进行DNA测序及序列分析；

（4）将正确克隆的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组HCRCN81蛋白质；

（5）采用SDS-PAGE电泳、质谱分析鉴定重组HCRCN81蛋白质；

（6）将所述HCRCN81蛋白质免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，制备脾细胞悬液；

（7）将同系的P3/X63-Ag8(X63)细胞与小鼠脾细胞融合制备P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞；

（8）采用体外培养法培养步骤（7）所述的阳性P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。

本发明收集人结直肠癌细胞、人结直肠癌组织和正常结直肠组织，制作冰冻切片与石蜡切片，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)对体外培养的人结直肠癌细胞、人结直肠癌组织癌细胞和正常结直肠组织正常腺细胞中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。

本发明提取人结直肠癌组织和正常结直肠组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Westernblot试验，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)对人结直肠癌组织和正常结直肠组织中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。