[发明专利]水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法

说明书

技术领域

本发明属于多肽组学技术领域，尤其涉及一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法。

背景技术

目前，随着生物学领域中蛋白质组学研究的深入，研究者们发现一类由氨基酸组成但又与蛋白质不同的物质，这类物质具有蛋白质特性，被称为多肽。在分类上，10个氨基酸以下组成的肽链称为寡肽，10个氨基酸以上称为多肽，在科研领域中，分子量小于10KDa的蛋白质被划分为多肽范畴。多肽是生命信息的体现者，各种生理变化和生化反应都有多肽参与。体内存在有上万种多肽，几乎所有的细胞生命周期都受多肽调节，涉及激素、神经递质、生殖生理等各个生命研究领域。多肽组学是研究体液（血液、脑脊液、卵泡液、尿液等）内全部多肽的一门学科，通过多肽分离和质谱鉴定技术精确地识别所有多肽信息，对于明确其前体蛋白质和生物来源具有重要的意义，多肽指纹图谱也逐渐被称为医疗领域内病理诊断指标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水牛卵泡液多肽组的制备方法，包括以下步骤：

（1）水牛卵泡液离心去除细胞碎片其他杂质，取上清液400μL，按体积比1:4向上清液中添加无水乙腈，沉淀并离心去除高丰度蛋白质；

（2）将步骤（1）所得沉淀并去除高丰度蛋白质后的样品转移至30000道尔顿超滤管上层，低温离心，取超滤管下层溶液；

（3）将步骤（2）所得下层溶液转移至10000道尔顿超滤管，低温离心，取超滤管下层溶液。

步骤（1）中水牛卵泡液离心采用3000×g离心15min。

步骤（1）中添加无水乙腈后室温25℃静置30min，离心去除采用8000×g离心15min。

步骤（2）和（3）中低温离心采用4℃、8000×g离心30min。

上述水牛卵泡液多肽组的质谱分析方法，其特征在于包括以下步骤：

（4）将步骤（3）所得下层溶液真空冷冻浓缩至20微升，用微量碳18反相色谱吸附柱脱盐处理；

（5）将步骤（4）得到的脱盐样品点在基质辅助激光解离串联飞行时间质谱仪的384样品孔靶上，待点靶样品干燥后，覆盖0.5微升芥子酸饱和溶液，氮气吹干；

（6）在质谱中设置合适的参数采集多肽组指纹图谱。

步骤（6）中质谱参数为加速电压2kV，使用标准品校正仪器质量轴和质量精确度小于0.3道尔顿；一级质谱激光强度为4200，完成一级数据采集后，动态选取20个最强的母离子进行二级质谱分析，二级质谱激光强度为4500，碰撞方式为源内诱导裂解。

发明人针对水牛卵泡液成分复杂难分析的问题，建立了一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法，先通过合理浓度的乙腈沉淀水牛卵泡液中的高丰度蛋白质，可有效去除高丰度蛋白质对检测的干扰，再通过不同孔径的超滤管多次过滤、截留不同分子量的多肽，能有效富集多肽组样品；脱盐处理后，用飞行时间质谱仪分析多肽组指纹图谱，在质谱检测时，通过合适的质谱分析条件，能高通量鉴定卵泡液多肽组信息。本发明精确、高效、费用低，实现了对水牛卵泡液中多肽组的高效制备和质谱检测，其检测结果可用于分析成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽组组分鉴定和差异分析，发明人据此发现了一批与卵母细胞成熟微环境卵泡液的生物标志物。

附图说明

图1是应用本发明获得的成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽组表达模式图，图中IMFF：未成熟卵泡液；MFF：成熟卵泡液。

具体实施方式

以下所用的试剂乙腈、芥子酸、水都是色谱纯，购自Sigma-Aldrich或Fisher试剂公司；30kDa、10kDa超滤管购自Millipore公司；质谱仪中离子化方式是基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪（Matrix-assisted Laser desorption ionization，MALDI），质谱为应用生物系统公司4800型飞行时间质谱仪。

实施例1

从屠宰场获取的水牛卵巢，将卵巢上卵泡按直径分为2个组：1）未成熟卵泡（直径<8mm）；2）成熟卵泡（直径>8mm）。使用注射器抽取水牛卵巢表面卵泡内的卵泡液分别收集，并将不同个体的卵巢内相同组别的样品混合，用于消除个体误差。按以下方法分别进行检测。