[发明专利]HSA长效融合蛋白及其快速组装及分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种HSA（人血清白蛋白，Human serum albumin）长效融合蛋白及其快速组装及分离纯化方法，具体为利用Bglbrick方法进行HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化，属于长效融合蛋白药物技术领域。

技术背景

Biobrick/Bglbrick方法是基于连接或聚合思想的不同尺度的DNA体外组装方法，此方法的诞生，加速了合成生物学功能元件库、生物合成途径乃至酵母染色体的人工构建，促进了代谢工程，基因组编辑、诱导性多功能肝细胞等领域的迅速发展。

Biobrick/Bglbrick方法是依赖于同尾酶的方法，同尾酶（如BglⅡ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ）是指一类识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能产生相同粘性末端的限制性内切酶。当酶切后的两个片段相连时，原来的酶切位点将不复存在，也就不能被原有的限制酶所识别，达到“焊死”状态。因此，该种方法仅利用一种同尾酶，就可以实现DNA片段的多次组装。虽然Biobrick/Bglbrick两种方法在连接处均会产生疤痕，但后者疤痕处翻译后为甘氨酸与丝氨酸，对于融合蛋白表达无影响，所以Bglbrick是推荐使用的方法。

Exendin-4:促胰岛素分泌肽又称艾塞那肽，从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一个激素物质，由39个氨基酸组成，GLP-1相似性高达53%，并且生物学效应也几乎完全一致。其能够增加胞内cAMP浓度，刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌，即在血糖浓度高时刺激胰岛素分泌，低浓度和正常浓度时不刺激胰岛素分泌，抑制β-细胞凋亡，刺激β-细胞的增殖与新生，还具有降低饥饿及餐后血糖浓度和胰高血糖素浓度；减缓胃排空、抑制食物吸收，节葡萄糖在外周组织的转运等生物学效应。Exendin-4在刺激胰岛素分泌的作用时依赖于血糖浓度，不会因为持续分泌而发生低血糖反应；能够降低食欲；对神经细胞具有保护作用；对二肽酰基肽酶-IV的高耐受性使其在体内的半衰期为2-3h，远长于GLP-1的1-2min，稳定性和生物活性明显高于GLP-1，有更好的治疗效果等优点。Exendin-4虽然具有比GLP-1长的半衰期，但半衰期仍较短。天然产物含量较少，而化学合成的Exendin-4存在成本较高，价格昂贵，步骤多，收率低，合成过程涉及有害化学物质等缺点。蛋白药物在体内存留时间的长短，极大的影响到药物的使用剂量和治疗效果，近几年国内外学者主要从化学修饰、基因融合等方面延长蛋白药物的半衰期，化学修饰中最广泛应用的修饰剂是PEG，可以使半衰期延长几倍几十倍甚至上百倍，但大部分蛋白的免疫原性会有所降低，蛋白的生物活性也会不同程度的下降。

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是血浆中的主要蛋白成分，也是许多内源因子和外源药物的载体，对维持体内渗透压和血浆体积起着非常重要的作用；正常情况下肾清除率较低。人血清白蛋白的分子量为66kD，是非糖基化蛋白，在体内的半衰期长达两周左右，因而是一种理想的生物活性蛋白载体。因此本发明提供了一种快速制备HSA长效融合蛋白及其分离纯化的方法以延长药物的半衰期，使这些药物的治疗效果等得到明显的改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种HSA长效融合蛋白及其快速制备和分离纯化的方法。

本发明的技术方案：

一种HSA长效融合蛋白，包含两个多肽区，第一区是由促胰岛素分泌肽Exendin-4（见序列表中序列1）的重复序列组成，第二区是由人血清白蛋白HSA（见序列表中序列2）的序列组成，第一区的C-末端与第二区的N-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连，或第一区N-末端与第二区C-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连；第一区的促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复次数为1-4次，Exendin-4的重复序列之间直接通过甘氨酸和丝氨酸相连。

一种HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，为利用Bglbrick方法进行HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化，包括HSA cDNA的PCR扩增及重组质粒的构建；含有Exendin-4重组质粒的构建；HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装；HSA长效融合蛋白的酵母表达系统构建；HSA长效融合蛋白的表达及融合蛋白的分离纯化。

上述方法包括如下步骤：