[发明专利]一种固定D-氨基酸氧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶固定领域，尤其涉及一种固定D-氨基酸氧化酶的方法。

背景技术

D-氨基酸氧化酶（DAAO）是一种催化氧化D-氨基酸的黄素酶。在生物体中，D-氨基酸的生理水平对调节成熟化、激素分泌和信号传导等过程具有至关重要的作用。例如，D-丝氨酸是中枢神经系统中的内生神经递质，对很多生理过程都起着关键作用。研究表明脑脊髓液中D-丝氨酸的降低和精神分裂症相关。因而越来越多的研究者开始关注于寻找D-氨基酸氧化酶的抑制剂来调节D-丝氨酸的水平，继而寻找治疗相关疾病的方法。目前常用的D-氨基酸氧化酶抑制剂方法有比色法和荧光光谱法等，然而这些方法一般在自由溶液中进行，具有操作复杂、稳定性差和酶不能重复使用等缺点。而酶固定的方法可以解决在自由溶液中酶反应引发的问题，因此，可以通过酶固定的方式来建立简单、高效的D-氨基酸氧化酶抑制剂筛选的方法。

磁性纳米颗粒固定化酶不仅具有良好的稳定性、较高的酶解效率，而且还具有能在保持酶活性的前提下反复使用、易从反应介质中分离和防止酶解产物污染等优点。在众多的磁性纳米颗粒固定化酶材料中，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的磁性纳米颗粒具有高官能度（环氧基团），因而酶负载量大，且能在温和的条件下和酶的氨基反应，因此是酶固定化材料的良好选择。然而，一般此类聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）修饰的磁性纳米颗粒和酶反应需要的时间较长，如室温搅拌24h，这对于D-氨基酸氧化酶这样的对环境敏感的酶是不利的。因此需要寻找有效的催化剂来提高酶的固定化效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定D-氨基酸氧化酶的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO₄在缓冲液中进行反应，得到固定有D-氨基酸氧化酶的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

上述方法使D-氨基酸氧化酶固定在载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒上。

上述方法中，所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒、D-氨基酸氧化酶与催化剂LiClO₄的质量比为20：5：2。

上述方法中，所述反应为：23-28℃反应1-5h，具体在本发明实施例中反应为25℃反应3h。

上述方法中，所述缓冲液为浓度为100.0mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液。

上述100.0mM、pH值为8.2的磷酸缓冲液配方如下：称取0.78g磷酸二氢钠溶于50mL水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调至pH8.2。

上述方法中，所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的分子量为27487，PDI为1.78，聚合度为193。

上述方法中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒按照如下方法制备：

1）用引发剂α-溴异丁酸（BIB）修饰Fe₃O₄磁性纳米颗粒，得到BIB修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒；其中，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒的粒径为12nm；具体操作步骤如下：将2g粒径约为12nm的Fe₃O₄磁性纳米颗粒和550mg的引发剂BIB在室温（25℃）下搅拌24h，然后用甲醇充分洗涤，再在50℃真空干燥12h，得到BIB修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

粒径约为12nm的Fe₃O₄磁性纳米颗粒采用传统的共沉淀法制备。

2）将步骤1）得到的BIB修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）在溶剂环己酮中、在催化剂CuBr和2,2’-联吡啶联用下，进行聚合反应，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒。