[发明专利]基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及生物样品微观观测方法及设备领域，尤其涉及一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置。

背景技术

纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。纳米技术应用广泛，包括1～100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内，研究这些微小物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。反过来，超分辨率显微成像技术的发展也推动了整个生命科学的进步。相比其他的显微技术，光学显微技术的一大优势是可以对处于自然状态的活细胞进行研究。

自世界上第一台光学显微镜问世以来，提高光学显微成像系统的分辨能力及测量范围一直是众多科学家致力研究的重要科学问题，特别是近年来，随着物理学、生物医学、微电子学和材料学等学科的迅速发展，对这一问题的研究变得尤为迫切，主要体现在：物理学的发展要求人们能观测到微观世界中原子的大小；分子生物学的发展要求人们能观测到活体细胞这种高散射物质内小到纳米尺度的单分子；微电子技术的发展要求人们能检测到超大规模集成电路中窄到数十纳米的线宽尺寸；纳米新材料的出现要求人们能观测到纳米尺度大小的纳米颗粒等，这些现代科学的新进展，更加促使人们不断地去探索高分辨显微成像的新方法和新技术。

由于衍射极限的存在，传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和1000nm。二十世纪三十年代发展起来的电子显微成像技术及八十年代初崛起的各类非光学的探针扫描显微成像技术具有纳米甚至更高的分辨能力，但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难，特别是不能获得样品重要的光学信息（如反射率、折射率、偏振态及光谱等信息），因而无法完全取代光学显微成像的地位。

随着现代激光技术、计算机技术、精密机械及电子技术的迅猛发展，超分辨的光学显微成像技术（Super-resolution Optical Microscopy,SROM）应运而生。在生物学领域，基于荧光非线性效应的生物超分辨光学显微成像技术的发展尤为迅速。目前，主流的生物超分辨光学显微成像技术主要分为两大类：一类是以S.W.Hell等人提出的荧光发射抑制显微术（Stimulated Emission Depletion Microscopy,STED）为代表的目标开关与读取显微技术（Targeted Switching and Read-out Mode）；另一类是以E.Betzig等人提出的光敏定位显微技术（photoactivated localization microscopy，PALM）、X.Zhuang等人提出的随机光学重构显微技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）为代表的随机开关与读取显微技术（Stochastic Switching and Read-out Mode）。前者以扫描方式成像，通过抑制光压缩系统的有效点扩散函数（Point Spread Function，PSF）直接提高系统的分辨能力；后者则是以宽场成像的方式，通过多幅图像重复拍摄的方法，对观察区域内的荧光分子进行随机定位，最终通过重构图像达到超分辨的目的。虽然上述两种方法均能够实现超分辨显微的目的，但是都并不完美，例如：目标开关与读取显微技术需要对样品施加较强的抑制光（一般为数百兆W/cm²）；而随机开关与读取显微技术则需要预先对观察区域内的荧光分子进行漂白。这两种情况都容易造成对观察样品不可逆的损害。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明综合了两种不同超分辨显微技术的基本原理，提供了一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法及装置，实现了对生物样品超分辨显微图像的获取。

一种基于荧光发射抑制机理的随机定位超分辨显微方法，包括以下步骤：

1）将同轴共路的激发光和抑制光同时聚焦在样品上；

2）在激发光和抑制光的共同作用下，样品上具有受激荧光发射特性的位置随机出射荧光，产生荧光信号；

3）收集荧光信号，生成稀疏荧光分布图像；

4）对稀疏荧光分布图像上的衍射斑进行单分子定位，生成荧光分子定位图像；

5）重复步骤3）和4），得到不同的荧光分子定位图像，经图像合成后得到样品的超分辨显微图像。

所述的超分辨显微，是指利用该方法获取的图像分辨率高于传统显微成像方法的分辨率，即高于所能分辨最小尺寸小于λ/2NA，其中λ为工作波长，NA为显微镜数值孔径。