[发明专利]一种盐酸多柔比星脂质体包封率的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于化学药品检测领域，特别涉及一种关于盐酸多柔比星脂质体包封率的测定方法。

背景技术

包封率是脂质体和纳米粒质量控制的一个重要的指标，反映了药物被载体包封的程度，药物和载体的浓度，制备过程中的条件是影响其包封率的主要因素。包封率包括百分包封率和包裹容积的测定，一般文献主要考察百分包封率(Encapsulation percentage,EN%)。其表达式是EN%=(1－Cf／Ct)×100％。式中Cf为游离药物的量；Ct为纳米粒或脂质体悬液中药物的总量。为准确测定包封率，将纳米粒或脂质体和游离药物分离是关键的步骤。由于脂质体或纳米粒比被包裹的药物粒子要大的多，可以利用它们的大小不同来分离除去未包裹的药物，这些方法有凝胶过滤柱层析法、渗析法等；如果被包裹的药物是蛋白质或DNA等，或未被包裹的药物可能形成较大的聚结物，则可以利用它们与纳米粒或脂质体浮力、密度不同而采用离心等方法进行分离。常见包封率检测方法如下：

1.柱层析法

凝胶渗透层析技术因其有效且快速而在实验室得到广泛应用。它可用于分离除去未包裹药物也可以对悬液中的脂质体或纳米粒大小分组。应注意的是脂质体或纳米粒被洗脱介质稀释后可能需要增加浓缩步骤。柱层析填料常用葡聚糖如Sephadex G-50，也有文献报道使用Sephadex G-25和Sephadex G-200，具体步骤为：在层析柱中装入用水或生理盐水或磷酸盐缓冲液溶胀的Sephadex G-50，将混悬液上柱，用水或生理盐水或磷酸盐缓冲液控制流速洗脱。选用凝胶的粒径大小、洗脱液的种类、洗脱的速度、温度对分离有重要的影响，在具体的实验中需要作出洗脱曲线以确定最佳的分离效果。

韩静等人在测定降香挥发油固体脂质纳米粒的包封率时采用柱层析法分离。条件是：Sephadex G-50柱（16cm×2cm），洗脱液为蒸馏水，流速为1ml／min，室温。移取降香挥发油固体纳米粒0.5ml上柱，以柱层析条件洗脱，每3ml收集一次。被包封的药物量应用含药量测定的HPLC条件测定。

何军等人将溶胀12小时的Sephadex G-25装柱，用80ml水洗脱，流速1ml／min，收集后40ml洗脱液进行测定(2)。紫杉醇长循环脂质纳米粒的包封率测定同样选用Sephadex凝胶柱，用水为洗脱液，接取其中带有蓝色乳光的部分测定。

栾立标等在测定酮洛芬明胶微球包封率时发现凝胶柱层析法除有准确、方便、微粒不易破坏、重现性好等优点外，还可以纯化微球，不仅可以除去未包裹的药物、无机盐等低分子量杂质，而且也可以分离出吐温-20。

高晓黎等对葡聚糖凝胶色谱法测定脂质体包封率的条件进行了筛选。对玻璃色谱柱，凝胶的粒径并不是越小越好，若凝胶颗粒太细，较大的脂质体可能被滞留在凝胶柱上，选用时要考虑被分离化合物的分子大小和性质。对于多层脂质体宜选用中粗级的凝胶（粒径大小50－150μm），而对于小单层脂质体则可以用任何级别的凝胶。在柱色谱过程中，所用的色谱柱的径高比，洗脱液的流速以及上样量的多少均影响从脂质体中分离游离药物，宜选择能使脂质体达到最大分离程度的洗脱条件，才能保证准确的包封率。还应注意的是葡聚糖表面存在着能与脂质体膜结合并相互作用的微小部位。虽然这种作用并不影响脂质体在凝胶柱上的流动特性，但仍可导致少量脂质的损失，使膜不稳定性增加，从而导致膜渗透性的改变及包裹物质的渗漏。这种现象在脂质浓度较低的情况下应予以特别的注意，一般可通过加大脂质体样品上柱量或用空脂质体预先将柱子饱和来解决。

2.渗析法

渗析法是利用脂质体或纳米粒粒子和药物分子大小不同，通过半透膜材料的膜孔截留作用将游离药物除去的方法。脂质体和纳米粒较大不能透过半透膜，而游离药物可以通过，一般把脂质体和纳米粒放在半透膜内，常用的半透膜材料有羊皮纸，动物膀胱和火棉胶等。膜外放纯溶剂，由于浓度差因素，膜内的游离药物不断向膜外渗透，经常更换膜外的溶剂，使游离药物被完全分离出来。此法是最简单的也是最常用的除去未包封药物的方法（大分子化合物除外）。它不需要复杂的技术，也无需昂贵的仪器，且能够扩大生产。通过不断改换渗析介质可除去所有的游离药物。但此法很费时，一般室温条件下，要除去95％以上的游离药物至少需要更换三次渗析介质，时间在10－24h以上。此外，渗析介质的渗透强度应与脂质体或纳米粒悬液的浓度一致，否则在渗析中就会改变脂质体和纳米粒悬液的体积，且可能引起包裹物质的渗漏。