[发明专利]一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法

权利要求书

1.一种用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂，其特征在于，包括：植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母冻干粉剂和单宁酶冻干粉剂。

2.一种制备如权利要求1所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂：将植物乳杆菌NL4-10，接种于MRS培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心后重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入等体积的脱脂乳溶液作为保护剂，预冻，再后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得植物乳杆菌冻干菌剂；

步骤B: 制备冻干产朊假丝酵母：将产朊假丝酵母GIM2.148，接种于麦芽汁培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心再重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入聚乙二醇和L-谷氨酸钠的混合溶液作为保护剂，预冻后进行冷冻干燥，即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂；

步骤C: 制备冻干单宁酶：将黑曲霉NC22接种于查氏液体发酵培养基培养，定性滤纸过滤后得胞外单宁粗酶液，再离心，上清液为胞外单宁酶液，将得到的上清液加入硫酸铵沉淀，再经蒸馏水透析除盐得到浓缩后的单宁酶液，再将单宁酶液按体积比加入聚乙二醇和甘露醇的混合液作为保护剂，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得单宁酶冻干粉剂；

步骤D：依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母和单宁酶：

D1： 植物乳杆菌复活：用水溶解MRS培养基，再加入植物乳杆菌冻干剂，常温下复活；

D2：产朊假丝酵母复活：用水溶解麦芽汁培养基，加入产朊假丝酵母冻干粉剂，常温下复活；

D3：单宁酶复活：在柠檬酸钠盐酸缓冲液中，加入单宁酶冻干粉剂，常温下复活；

步骤E：将步骤D1、D2和D3所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰ cfu/mL；

步骤F:将香蕉茎叶切成2-4cm大小，处理至其含水量在60%~65%左右，将步骤E所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入发酵桶中，压实、密封后在常温下避光，即可制得香蕉茎叶青贮饲料。

3.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌NL4-10与MRS培养基，产朊假丝酵母GIM2.148与麦芽汁培养基的质量比均为1:10，冻干单宁酶与柠檬酸钠盐酸缓冲液培养基的质量比为2:1。

4.如权利要求3所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述查氏液体发酵培养基含质量分数2%的单宁酸。

5.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤A和步骤B中，静置培养的温度为37℃和28℃，时间均为36小时。

6.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤C中，培养的温度为30℃，速率为120r/min，时间为72小时。

7.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤A和步骤B中，离心的温度为4℃，时间为10分钟，速度为10000×g，无菌磷酸盐的pH值为6.5。

8.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤A、B和C中的预冻方法包括：-20℃预冻2小时后，-80℃再预冻8小时，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-60℃，真空度为4-6Pa，真空冷冻干燥时间为16小时。

9.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，步骤A中，所述脱脂乳溶液的质量浓度为10%，所述步骤C中，硫酸铵沉淀的浓度为2mol/mL，与胞外单宁酶液的体积比5%。

10.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，步骤B中的保护剂中聚乙二醇的体积比为1%，L-谷氨酸钠的质量分数为7%；所述步骤C中的保护剂中聚乙二醇和甘露醇的混合液与浓缩后的单宁酶液体积比均为1%。