[发明专利]一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法。

背景技术

细胞是生物体的基本结构单位。细胞的生命活动是在内、外环境的动态平衡过程中进行的。细胞和组织遭受不能耐受的有害因子刺激时，则可能引起损伤。较轻的细胞损伤是可逆的，消除刺激因子后，受损伤细胞可恢复常态，通常称之为亚致死性细胞损伤。细胞的严重损伤是不可逆的，最终引起细胞死亡。引发细胞损伤的原因很多，可以归纳为：缺氧、化学物质和药物、物理因素、生物因子、营养失衡、内分泌因素、免疫反应、遗传变异、衰老等若干大类。

由多种因素引发的细胞损伤，其发生机制复杂。细胞膜的破坏、氧自由基增多、胞浆内高游离钙、缺氧、化学毒作用和遗传物质变异等，对于细胞损伤的发生具有重要意义。这几方面的机制通常是相互结合或是互为因果地导致细胞的损伤。缺氧是诸多致病因素引起细胞损伤的一个非常重要的基本环节。多种原因引发的缺氧最终都导致线粒体氧化磷酸化受抑制，使细胞能量来源三磷酸腺苷（ATP）生成减少，造成细胞膜钠-钾泵、钙泵功能低下和胞浆内蛋白质合成、脂肪代谢障碍等，造成无氧糖酵解过程的活化。酵解会进一步使细胞酸中毒、溶酶体膜破裂、大量降解酶释放形成细胞自身消化。缺氧还可使氧自由基等活性氧类物质增多，膜磷脂丢失，脂质崩解，细胞骨架破坏等。轻度、较短时间缺氧所致的细胞损伤通常是可逆的，严重缺氧或/和较长时间的轻度缺氧所致的细胞损伤是不可逆的，引发细胞坏死。

包括移植用供体器官在内的某些状态下的组织器官，由于缺氧而造成不可避免的、不同程度的细胞损伤。这些细胞损伤可直接引发误诊、误治：对于器官移植手术来说，移植排斥反应是移植失败的主因，而供体器官的质量下降可以引起超急性排斥反应和慢性排斥反应，因此供体器官质量是移植成败的重要决定因素之一。供体器官质量是由供体来源（活供体、脑死亡供体、死亡供体）、供体健康状况、热缺血时间、灌注保存方法、冷储存时间、运输方式等多种因素综合决定。由于移植医学的特殊性，供体群趋于老龄化、活供体源远远少于需求，因而死亡供体成为主要器官源，使相应的供体器官质量远远无法保障。本应在移植手术前对供体器官的质量进行严格评估，然而，世界上目前除了配型和病毒检测以外，没有对供体器官的质量监控的任何其他手段，只是对供体器官的“保质期”有大致的限定，从而造成相当一部分移植手术因源标本质量问题而失败，即便移植手术成功，受过损伤的供体器官往往也不具备正常器官的功能，使患者不必要的接受一次无意义的手术，无谓地加重病人经济负担、社会保险负担，更重要的是，使病人多承受一次危及生命的手术创伤。

目前在器官移植以外的科研、医疗领域，对细胞损伤的检测手段主要有：利用细胞缺氧后失去能量合成而致使三磷酸腺苷（ATP）水平下降为原理，对三磷酸腺苷／二磷酸腺苷比值（ATP/ADP)的检测。此类以检测氧、养为标准的对细胞损伤的评价方法，由于在常规供体器官采样操作中需要对供体器官进行灌注，而灌注液里含有上述ATP等成份，因而针对上述成份的检测无法在对供体器官质量的评估中使用，类似方法还包括针对细胞损伤后的有害分子一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）等成份的细胞损伤评估手段。

综上所述，目前急需研发一种能够广泛应用于对器官移植中供体器官内细胞损伤进行定量评估的技术方法，以保障移植手术的合理性以及对移植术后效果的预测。

维持细胞骨架蛋白等基本组成结构的正常功能是保障细胞生存的前提。胞衬蛋白是一种细胞膜骨架蛋白,一个较大的异源二聚体蛋白,由α亚基和β亚基组成,并且具有典型的106个氨基酸构成的被称作α胞衬蛋白重复体的连续基序，在维持细胞膜的稳定、结构及形状中起重要作用。随着对α胞衬蛋白结构与功能地深入研究,人们发现α胞衬蛋白还参与多种生物途径,如细胞粘附及细胞伸展、细胞周期等。更重要的是，从病理学角度出发，骨架蛋白的损伤与细胞膜损伤、溶酶体释放一道是细胞不可逆损伤的三大标志，最终导致细胞核崩解而完全失去生命行为及生理功能。因此，α胞衬蛋白，作为细胞骨架和细胞膜的重要组成部分，是细胞不可逆损伤的评价指标。