[发明专利]一种细菌木糖异构酶基因及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种木糖异构酶基因，特别涉及来自细菌Clostridium sp.B1的木糖异构酶基因及其转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及该工程菌在发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。

背景技术：

木糖异构酶能够将木糖异构化成木酮糖，利用其，可将植物的木质纤维素中的木糖作为碳源，发酵生成乙醇。

现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。曾有人分别克隆表达了多种来源的木糖异构酶基因，如Escherichia coli，Bacillus subtilis，Thormotoga species，Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。

较少有从细菌中筛选出的木糖异构酶基因能够在酵母里得到良好表达活性的报道。

发明内容

本发明的目的是从细菌中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。

本发明所要解决的技术问题如下：

从细菌中筛选出一种新的木糖异构酶基因；

提供包含上述木糖异构酶及其基因的重组载体；

提供包含上述木糖异构酶基因的重组菌株；

将所得上述重组菌株应用于转化木糖生成木酮糖，进而生成乙醇。

本发明人通过筛选，发现了一种天然菌株厌氧细菌Clostridium sp.B1，从该细菌中获得了一种新的木糖异构酶，命名为XI。并得到了一种编码该酶的木糖异构酶基因xylA，实验证明，该基因具有将木糖转化成木酮糖的功能，适合于在能源、酿酒以及食品工业中使用。

虽然本发明最初是通过筛选到该细菌完成的发明，但本发明的结果是得到了基因序列。他人不依赖这种细菌，只要得知序列就可以获得一种新的木糖异构酶，能够将木糖异构化成木酮糖，利用其，可将植物的木质纤维素中的木糖作为碳源，发酵生成乙醇。

所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该xylA基因编码的木糖异构酶XI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明将上述木糖异构酶基因xylA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到包含木糖异构酶基因xylA的重组质粒。所述表达载体优选为酿酒酵母多拷贝表达载体pYES2，得到重组质粒pYES2-CXI。

作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是质粒pYES2上的Spe Ⅰ和Xba Ⅰ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于TPI1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pYES2-CXI。

本发明将上述重组酵母表达质粒pYES2-CXI转化进入宿主细胞，得到可以高效表达上述木糖异构酶的重组菌株。

所述宿主细胞为酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选宿主细胞为酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae），更优选的，是将重组酵母表达质粒转化酿酒酵母细胞CEN.PK113-5D，得到重组菌株C（详见实施例4）。

本发明还提供了包含上述木糖异构酶基因的重组菌株，优选为重组菌株C。重组菌株C能够高效表达上述木糖异构酶，该酶可用于发酵含有木糖的物质，将木糖转化成木酮糖，进而代谢生成乙醇和其他发酵产物。本发明还提供了一种所得木糖异构酶的应用，包括以下步骤：

1、用权利要求重组质粒转化宿主细胞，得到重组菌株C（详见实施例4）；

2、培养重组菌株C，表达重组木糖异构酶。

其中，本发明的木糖异构酶具有以下应用范围：

1、能源工业：

可以将木质素纤维素水解物中大量存在的的D-木糖转化为D-木酮糖，而D-木酮糖又可被传统的乙醇生产菌株如酿酒酵母转化成有价值的燃料。

2、食品工业

木糖异构酶可以在体外催化D-葡萄糖转化为D-果糖，因此又被称为“葡萄糖异构酶”。这后一种活性在工业中可用于生产果葡糖浆，可作为食品添加剂。果葡糖浆是一种完全可以替代蔗糖的产品，并与蔗糖一样可广泛应用在食品及饮料行业。

具体实施方式