[发明专利]一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法

权利要求书

1.一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，包括以下步骤：

（1）用利马豆液体培养基或燕麦培养基稀释烯酰吗啉，配置各种质量浓度的药剂；

（2）将烟草黑胫病菌在利马豆固体培养基平板上培养4d，取菌落1/3处直径为5mm的菌丝块10块，放入盛有20mL10%V8培养液培养皿中，光照培养4d后菌丝表面形成大量的孢子囊；将形成孢子囊的黑胫病平板置于4℃冰箱低温处理30min，然后再置于室温2h，从溶液中收集游动孢子悬浮液，将其浓度调整为1×10⁴个/mL，贮存、待用；

（3）8通道电动移液器将8种不同质量浓度的药剂每孔140μL加入到96孔微孔板中，并设置空白对照组；无菌条件下，在96孔微孔板中每孔加入1×10⁴个/mL的游动孢子悬浮液10μL；盖好96孔板板盖，将96孔微孔板置于监控培养箱中，28℃黑暗条件下培养72h，采用生长曲线监控软件读取0-72h小时黑胫病菌生长曲线的数据；培养0和72h时，采用浊度测定软件测定590nm每孔黑胫病菌的OD值(处理0和72h的吸光度值分别记为OD₀和OD₇₂₎，按照公式(1)计算杀菌剂对黑胫病菌孢子萌发的抑制率，并计算药剂对菌株孢子萌发的EC₅₀值；

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2.如权利要求1所述的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，其中第（3）步可为下述方法：在无菌条件下，在96孔微孔板中每孔加入1×10⁴个/mL的游动孢子悬浮液10μL，将其置于监控培养箱(BioLog OminLog)中，于28℃黑暗条件下培养24h后，再分别加入140μL经利马豆培养基稀释过质量浓度为2、1、0.5、0.25、0.13、0.063、0.031mg/L的烯酰吗啉药剂，设置添加同体积无菌水为空白对照组；采用浊度测定软件(Microstation)测定96孔微孔板590nm的OD值（处理0h的吸光度值为OD₀），将微孔板继续置于监控培养箱(BioLog OminLog)中黑暗条件下培养，采用生长曲线监控软件(OminLog-PM)读取0-72h小时黑胫病菌生长曲线的数据；于72h后再次测定OD值（处理72h的吸光度值为OD₇₂）,按照公式(1)计算药剂对菌丝生长的抑制率，并计算药剂对菌株菌丝生长的EC₅₀值。

3.   如权利要求1或2所述的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，其中利马豆液体培养基的配置方法为：称取60g利马豆于800mL无菌水中煮沸1h，过滤，滤液定容至1L，灭菌、待用；利马豆固体培养基的配置方法为：称取60g利马豆于800mL无菌水中煮沸1h，过滤，滤液中添加16g琼脂粉，煮沸定容至1L，灭菌、待用。

4.如权利要求3所述的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，其中10%V8液体培养基的配置方法为：100mLV8营养液1500rpm离心5分钟，收集上清液，并加入0.2gCaCO₃，加去离子水至1L，pH6.5～7.5，经灭菌后分装待用。