[发明专利]利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，利用新的接种方法对蛹虫草菌株进行复壮和提高子实体产量的方法。

背景技术

真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础。据目前所知真菌交配系统包括同宗配合和异宗配合两种。由同一孢子萌发的菌丝间能通过自体结合而产生有性孢子，这一自交可育的生殖方式称为同宗结合，同宗结合还包括初级同宗结合和次级异宗接合两种。必须由不同性别的菌丝接合产生的双核菌丝才具有结实性，可产生有性孢子，这种自交不育的有性生殖方式称为异宗结合，异宗接合还包括两极性和四极性异宗接合。对真菌交配型的研究及减缓菌株退化，改良菌种具有重要作用。

蛹虫草(Cordyceps militaris)具有极高的药用价值，是一种异宗配合的子囊菌，异核体所产生的有性后代中具有两种可亲和的交配型，即mat-alpha和mat-HMG两种交配型。研究表明，当菌株只含有其中一类交配型不能够完成有性生活史，只有当同时含有这两种交配型时才能完成有型生活史，具备形成具有子囊壳的子实体。因此，研究蛹虫草菌株在生长过程中所需的两种交配型的最优比例，对提高蛹虫草子实体产量、退化菌株的复壮和减缓菌株菌株退化具有重要意义。

近年来，对蛹虫草交配型的报道和研究日益增多，但是有关蛹虫草两种交配型比例与菌株生长状况之间关系的研究报道很少。继2005年Yokoyama等成功获得蛹虫草的mat-alpha和mat-HMG两种交配型基因的全长序列后(序列号分别是AB194982和AB084257)，zhang等2013年利用子囊孢子弹射获得蛹虫草单孢株后，PCR检测单孢株的交配型，将不同交配型单孢菌株混合培养得到的子实体产量是单一交配型(mat-alpha或mat-HMG)菌株的5倍。但是Zhang等利用子囊孢子弹射获得单孢株的方法比较繁琐，且准确度较低，同时Zhang等并没有找到高产子实体的两种交配型菌株的最优比例。

本发明通过对蛹虫草分生孢子单孢分离获得单孢菌株，PCR检测单孢株的交配型得到mat-alpha和mat-HMG两种交配型菌株，按照mat-alpha与mat-HMG菌株特定比例的量接种于柞蚕蛹上获得高产的子实体，按照mat-alpha与mat-HMG菌株特定比例的量接种于米饭培养基上获得高产的子实体，传代多次的菌株单孢分离获得两种交配型单孢株后，按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到柞蚕蛹上或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。

本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并按特定比例接种到柞蚕蛹或者米饭培养基获得高产子实体，这种方法在国内外未见报道。同时传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到柞蚕蛹上或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量，这一方法在国内外也未见有报道。

发明内容

本发明是提供了一种快速提高子实体产量的方法，同时克服了菌株传代多次导致子实体产量迅速降低的问题。本方法可以直接用于生产，是一种提高子实体产量快速而又简洁的方法。

本发明通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株。

本发明利用对获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养5天后测摇瓶菌丝质量体积比，最后换算得到单位体积内两种交配型单孢株菌丝质量比。

本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株1：12的质量比接种于柞蚕蛹上获得高产的子实体。

本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株1：12的质量比接种于米饭培养基上获得高产的子实体。

本发明通过对传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG菌株1：12的质量比接种到柞蚕蛹或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。

附图说明

图1为孢子在20h刚萌发伸长，箭头所指为孢子。

图2为对不同单孢菌株的交配型PCR产物的检测，上面为mat-alpha(180bp)、下面为mat-HMG(210bp)。

图3为蛹虫草菌株接种到柞蚕蛹，从左到右依次为mat-alpha与mat-HMG菌株1二12的质量比接种、原始蛹虫草混合菌株接种、单交配型菌株接种。

图4为蛹虫草菌株接种到米饭培养基，接种菌株顺序同图2。