[发明专利]一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

干细胞是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞（Adult stem cells）和胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞等，在成体组织中存在的。

1981年，ESCs的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的干细胞的代始于1998年，美国科学家James A.Thomson带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出ESCs株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征，此项研究论文发表在顶级学术期刊“Science”上面。人ESCs细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以人ESCs作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制人ESCs分化培养环境、转染能够促进人ESCs定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。

然而，一直以来，人ESCs研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：（1）供体卵母细胞的来源困难，人ESCs建系效率低。此外，体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证；（2）免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对人ESCs分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应；（3）人ESCs具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题。

为避开人ESCs和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，英国剑桥大学Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入非洲爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4基因则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4基因。

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因等4个多能性因子，通过逆转录病毒将上述4个多能性因子导入小鼠胎儿成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ESCs的培养条件下获得了多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、基因表达谱、表面抗原标记物、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性、形成畸胎瘤等方面与小鼠ESCs非常相似，故将其命名为诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。

接着，Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个多能性因子导入到人皮肤成纤维细胞中，成功获得了人iPSCs。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为人iPSCs。这类iPSCs的各方面特性与人ESCs非常相似，并且在体外培养形成的拟胚体时和在小鼠体内形成的畸胎瘤中均可分化为三个胚层的不同细胞类型。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞重编程为具有人ESCs基本特征的iPSCs，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转染。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。