[发明专利]稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株表达重组鸡白介素的细胞系，尤其涉及一株稳定表达鸡白介素10融合蛋白的细胞系，本发明进一步涉及该细胞系的构建方法及其应用，属于重组鸡白介素10蛋白的制备领域。 

背景技术

白细胞介素简称白介素，是由白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。随着分子生物学的发展，有关鸡白介素基因和功能的研究已逐渐成为热点，迄今为止，已从鸡中分离出多种白介素，例如：IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18等，这些白介素能够应用于免疫治疗剂、免疫增强剂、构建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫，不仅会有效防控畜禽疾病，还能在畜牧业生产中产生巨大的经济效益。 

现有的制备重组鸡白介素10蛋白的基因工程方法不同程度的存在着表达效率较低、表达不稳定等缺陷，有待改进。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一株稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系； 

本发明的目的之二是提供构建所述稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系的方法； 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

本发明分别扩增鸡chIL-10全部编码基因（euchIL-10F）和鸡去信号肽编码基因（euchIL-10M），分别定向克隆于含有报告基因eGFP和新霉素抗性基因（neo）的真核表达载体pEGFP-N1中，经酶切及测序鉴定，获得重组质粒N1-euchIL-10F和N1-euchIL-10M。本发明将获得的重组质粒N1-euchIL-10F和N1-euchIL-10M分别转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1细胞，经G418加压筛 选、纯化，获得表达chIL-10蛋白的细胞系CHO-chIL-10M和CHO-chIL-10F。CHO-chIL-10M和CHO-chIL-10F细胞系经过连续2次单克隆纯化，传代培养至第26代，在FITC滤光通道下，CHO-chIL-10M仍能够观察到报告基因eGFP蛋白激发的强绿色荧光，而CHO-chIL-10F荧光较弱；实验结果表明2种重组真核表达质粒都能在CHO-K1细胞中表达重组鸡白介素10蛋白，但是细胞系CHO-chIL-10M表达重组鸡白介素10蛋白的表达效率要远远高于CHO-chIL-10F表达重组鸡白介素10蛋白的表达效率，且细胞系CHO-chIL-10M表达重组鸡白介素10蛋白的稳定性要远远优于CHO-chIL-10F的稳定性。 

RT-PCR鉴定结果表明，chIL-10全部编码基因（euchIL-10F）和鸡去信号肽编码基因（euchIL-10M）分别在CHO-chIL-10F和CHO-chIL-10M细胞系中获得稳定表达，但是CHO-chIL-10M细胞系中鸡去信号肽编码基因的的表达强度是CHO-chIL-10F细胞系中chIL-10全部编码基因的4-6倍左右。 

Western blot检测结果显示，chIL-10全部编码基因（euchIL-10F）和鸡去信号肽编码基因（euchIL-10M）均在细胞中得到正确表达，但是CHO-chIL-10M细胞系中鸡去信号肽的白介素10编码基因的表达量要远远高于CHO-chIL-10F中鸡白介素10全部编码基因的表达量。 

IFA检测结果表明，鼠抗chIL-10血清与细胞系CHO-chIL-10F和CHO-chIL-10M均呈现特异性红色荧光，而兔抗chIL-10血清不与任何细胞株反应。 

有无信号肽对IL家族成员体外表达的效果是事先难以预期的。李行（李行，稳定表达鸡IL-18蛋白细胞系的建立及鸡IL-18单克隆抗体的制备，2012，硕士论文）研究发现，在其它条件相同情况下，与不含信号肽相比，鸡IL-18有信号肽会明显促进其体外表达的效率或表达量；本发明的实验非常意外的发现，将鸡IL-18的信号肽去掉后，其在细胞中的表达效率或表达量要远远高出鸡白介素10全长基因的表达效率或表达量。 

鉴于CHO-chIL-10M细胞系中鸡去信号肽的白介素10编码基因的表达 量或表达效率远远高于CHO-chIL-10F中鸡白介素10全部编码基因的表达量或表达效率，本发明将细胞系CHO-chIL-10M提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.7659；分类命名为：中国仓鼠卵巢细胞系。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年5月29日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；