[发明专利]一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法

权利要求书

1.一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)检测准备：

①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果不立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存；

②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF稀释后混合；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；

③DNA引物和探针：

所用的对应突变型BRAF V600E的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3；

所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3；

所用的BRAF的反向引物序列为：

5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；

所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；

所用的分子信标的序列为：

5-FLUOROPHORE-GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC-QUENCHER-3；

(2)检测程序：

①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液；

②准备以下检测反应混合物，体系20μl包含：

所述的5×引物混合液中含有75％二甲基亚砜，突变型BRAF V600E的正向引物(序列为5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3和BRAF的反向引物(序列为5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)各1mM，检测到的结果是突变型BRAF的含量；

如果加入的引物是野生型BRAF正向引物(序列为5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3)和BRAF的反向引物(序列为5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)，那么检测到的结果就是野生型BRAF的含量；

③将反应混合液(未加入样本)加入到微测试孔中，每孔19μl；

④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10-100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；

所述的酶混合物中含有：山梨醇、牛血清白蛋白、核糖核酸酶H、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶；

⑤通过监测荧光信号来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF V600E或者野生型BRAF的含量。

2.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(1)的①中如果组织样本未立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存。

3.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(1)的②中从两种细胞系中分别提取总RNA，并用分光光度计进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF按照以下稀释比进行混合(突变型RNA：野生型RNA)：100％、10％、1％、0.1％。

4.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)的①中将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液。