[发明专利]鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)，特别涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法，属于生物技术领域。 

  

背景技术

鸡传染性喉气管炎(Avian infectious laryngotracheitis，AILT)是一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病, 该病由疱疹病毒科-α疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(ILTV)引起，传播快，临床特征是伸颈、张口呼吸、咳血痰，死亡率增高和产蛋下降。天然感染的主要途径是上呼吸道和眼结膜。自然感染的潜伏期6～12d。气管内接种2～4d即可发病。病程一般为10～14d。易感鸡群发病率可达90％～100％，死亡率达20％～30％，有合并感染时可高达50％以上，造成养鸡业的严重损失。 

目前病毒的培养方法主要有自然宿主、实验动物（易感动物）接种、传代培养、鸡胚接种或细胞培养等。其中鸡胚接种培养技术比组织培养容易成功，也比接种动物的来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，因此是常用的一种培养病毒的方法，此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。 

发明内容

本发明技术为鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)的鸡胚培养方法，包括以下步骤： 

将鸡传染性喉气管炎病毒株用病毒稀释液（为每lmL灭菌生理盐水含盐酸环丙沙星l0μg）进行5倍稀释，作为原液，再按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的梯度稀释，然后把5个梯度稀释的0.2mL病毒液经绒毛尿囊膜，分别接种于10日龄SPF鸡胚。以及

鸡胚在数字智能化孵化机中37℃、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次。48小时弃去死亡鸡胚，观察至148小时，详细记录死亡与存活数。无菌收集72～148小时死亡鸡胚，3500r/min离心20 min，取上清液，用于下次传代培养。

如此重复三次，共传3代。无菌收集72～148小时死亡鸡胚。将发生病变的尿囊液及绒毛尿囊膜置于组织研磨器中，逐渐加入尿囊液，充分研磨，4000r/ min离心30 min，取上清液，即为ILTV病毒液（种子液），-20℃保存。 

其主要特点是：

（1）鸡胚的来源比自然宿主、实验动物（易感动物）和细胞等材料更容易获得，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般，培养的成本低；

（2）接种方法简便易行，SPF鸡胚无杂菌，无病毒隐性感染，培养纯度高，培养时间短。

（3）病毒繁殖速度快，扩增量大。 

总之，本技术发明具有取材容易、效率高、速度快、简便易行等优点。可用于鸡传染性喉气管炎病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。 

 附图说明

图1是本技术发明鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚培养方法的流程图  

具体实施方式

1.病毒稀释

将鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)标准株用病毒稀释液进行5倍稀释，作为原液。再按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的梯度稀释后接种鸡胚。

2.鸡胚接种与培养条件 

采用FT-K数字智能化孵化机。所用SPF鸡胚为自行孵化，取10日龄鸡胚35枚，分为7组。每个鸡胚分别接毒10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5梯度的病毒稀释液0.2mL，每个稀释梯度用5枚鸡胚，其余5枚鸡胚作为对照组接种生理盐水。37℃、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次。弃去48h内死亡鸡胚，观察148h，详细记录死亡与存活数。无菌收集72～148h死亡鸡胚，3500r/min离心，取上清液，作为种子液，-20℃保存待用。

3. 鸡胚半数致死量（ELD50） 

按Reed-Menuch氏法计算ILTV的鸡胚半数致死量（ELD50）。

距离比值=(66.7%-50%)/(66.7%-33.3%)=0.50。 

Lg EID₅₀=-2+0.50×(-1)=-2.50。