[发明专利]一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法及制备的药物

说明书

技术领域

本发明属于CB1拮抗剂应用领域，尤其涉及一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法及用其制备的治疗脑血管疾病、戒烟和减肥药物。 

背景技术

大麻受体是一种G蛋白偶联受体，有两种亚型受体CB1和CB2。CB1受体在中枢神经系统、肺、肝脏、肾脏等外周组织中表达。中枢CB1受体主要与抑制食欲、减少摄食有关，而外周CB1受体主要与调节体内能量代谢，减轻体重有关。CB1受体是一类影响人类食欲与能量代谢的受体，利莫那班是第一个选择性作用于CB1受体的拮抗剂，CB1拮抗剂是治疗肥胖症、戒烟和治疗脑缺血疾病的重要靶标，选择性作用于CB1受体的拮抗剂受到了广泛的关注。 

目前筛选CB1拮抗剂的方法主要是药物化学的方法和建立CB1细胞筛选模型进行高通量药物筛选。具体如下： 

一、中国人民解放军军事医学科学院/解放军军事医学科学院，药物化学专业硕士研究生陶晓璇，郑志兵等硕士论文“CB1受体拮抗剂的设计、合成与生物活性评价”，通过CB1受体拮抗剂与其受体的相互作用，建立了“4-甲基-1H-二芳基吡唑类”CB1受体拮抗剂的构效关系。基于已经建立的构效关系，并在充分考虑CB1与CB2的结构相似性、拮抗剂的过膜能力等前提下，以利莫那班作为先导化合物，对其吡唑环3位进行结构修饰，设计了包括季铵盐类、脲基类和胍基类等三类具有较高亲水性的化合物，期望得到具有高亲和性且不易透过血脑屏障的最大限度的减少中枢副作用选择性作用于外周组织的CB1受体拮抗剂。 

二、华东理工大学制药工程专业，胡慧、朱为宏等硕士论文“大麻素1（CB1)受体小分子拮抗剂的筛选及其模型建立”。他们建立CB1受体小分子拮抗剂筛选平台，具体如下： 

1)通过在CHO-K1细胞株上共转染CB1受体和Ga15质粒，建立稳定表达CB1受体以及Ga15的细胞株(hCB1R-CHO)； 

2)利用hCB1R-CHO细胞株，建立基于检测钙信号CB1受体拮抗剂筛选模型，并对各种实验条件(如细胞密度、Fluo-4AM的浓度和荧光染料孵育时间等)进行优化，使之符合高通量药物筛选的要求； 

3）应用建立的模型，探索筛选专一性强、亲和力高、毒副作用低的新型CB1受体选择性拮抗剂。应用该模型，论文筛选了364个小分子化合物，将筛选得到的活性化合物经GTP-Eu竞争结合试验、毒性实验、交叉实验等做进一步验证，成功地发现一个新型CB1受体拮抗剂，其IC50值达到1.3μM。 

目前，已有药物利莫那班不良反应明显，已经被世界上停售。EGCG通过拮抗CB1受体，可用于脑血管疾病、减肥和戒烟，国内外未见报道。如何整合出一套完整的CB1拮抗剂筛选路线，获得一个可以通过作用于CB1产生可用于防治脑血管疾病、减肥和戒烟的新药是近期困扰着人们的一个难题。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种用于验证CB1拮抗剂EGCG治疗脑血管疾病、戒烟和减肥效果的方法，旨在解决近期困扰着人们的如何整合出一套完整的CB1拮抗剂筛选路线，获得一个可以通过作用于CB1产生可用于防治脑血管疾病、减肥和戒烟的新药的问题。 

本发明实施例是这样实现的，一种用CB1拮抗剂EGCG的制备方法，该拮抗剂EGCG制备方法包括步骤： 

步骤一，重组人CB1真核表达载体的构建； 

组织总RNA的提取：取脑组织称重108mg，加入1.0ml Trizol，放入匀浆器中于冰上研磨，转入1.5mlEP管，混匀，静置5min后加入200μl氯仿，低温离心机，4℃，12000rpm，离心15min，取上层水相移入EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置1Omin，低温离心，加入1ml预冷的0.1％DEPC水配制的75％乙醇洗涤沉淀，超净台风干30min，加入400μl DEPC处理水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断RNA的完整性，紫外分光光度计测定OD值并计算RNA浓度，-80℃保存备用； 

引物设计与合成：根据Genbank公布人CB1基因序列设计引物，在上游引物的5′加入HindIII酶切点，下游引物5′加入EcoR I酶切点，由上海英骏生物技术有限公司合成；