[发明专利]一种激光扫描位相显微成像方法及系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种光学成像方法及系统，特别是关于一种激光扫描位相显微成像方法及系统。

背景技术

激光共聚焦荧光扫描显微技术是利用置于探测器前的针孔，高质量地对荧光实现点扫描和点探测的成像过程。激光共聚焦荧光扫描显微技术图像的对比度来自于激光激发样本产生的荧光强度，因此不能单独实现对透明样品进行非荧光标记的结构成像。

现有技术中可以与激光共聚焦荧光扫描显微技术结合的生物组织显微位相成像方法主要包括：1、激光斜射照明显微成像方法是在共聚焦显微系统的基础上，利用入射激光光轴和探测光轴所成的角度获得斜入射的照明光，从而获得浮雕效果。但是由于需要调节探测光路和入射光路的角度，难以实现在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上实现位相测量。2、微分干涉相差显微成像方法利用两块渥拉斯顿棱镜（Wollaston Prism），起偏器（Polarizer）和检偏器（Analyzer）完成成像，成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，但是上述显微成像方法需要在光路中额外添加偏振元件产生偏振光，并利用两束偏振光形成的剪切角进行位相差分探测，其所采用的偏振元件价格昂贵且不能对具有双折射特性的样品进行探测。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种激光扫描位相显微成像方法及系统，能够在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上实现位相测量。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种激光扫描位相显微成像方法，其包括以下步骤：1）设置一包括有激光共聚焦荧光扫描显微系统的激光扫描位相显微成像系统，激光共聚焦荧光扫描显微系统包括有激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器；2）将一生物样品放置在扫描平台上；3）根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4）在生物样品上方添加荧光介质，并对荧光介质上的荧光物质的浓度进行调制，荧光介质的不同位置代表不同的荧光物质浓度；在对生物样品扫描过程中需要满足照射到荧光介质上的激光光斑能够照亮荧光物质浓度发生变化的区域；5）激光器发出确定光斑尺寸的激光，并发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上；6）聚焦到生物样品的激光透过生物样品后照射到荧光介质上，且荧光介质被激光激发发射荧光；7）激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光发射到会聚透镜并经针孔由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相；8）扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，重复步骤5）～7）直到得到生物样品的所有测量点的位相；9）将光电探测器探测得到的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。

所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述步骤5）在激光器出射光路的方向上固定设置所述激光透光部件，激光器出射的激光经所述激光透光部件后发出确定光斑尺寸的激光并发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上。

一种激光扫描位相显微成像方法，其包括以下步骤：1）设置一包括有激光共聚焦荧光扫描显微系统和位相探测系统的激光扫描位相显微成像系统，其中，激光共聚焦荧光扫描显微系统包括有激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器，位相探测系统包括有荧光挡光部件，其中，会聚透镜和荧光挡光部件构成一探测荧光组件；2）将一生物样品放置在扫描平台上；3）根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4）在激光入射到生物样品的方向，生物样品上方添加荧光介质；5）在二向色镜与针孔之间固定设置探测荧光组件；6）激光器发出确定光斑尺寸的激光发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上；7）聚焦到生物样品的激光透过生物样品后照射到荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；8）激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光被探测荧光组件部分遮挡，未经探测荧光组件阻挡的荧光经针孔由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相；9）扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，重复步骤6）～8）直到得到生物样品的所有测量点的位相；10）将光电探测器探测得到的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。