[发明专利]巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基共表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基基因序列、含有该基因的重组载体、重组菌以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。 

背景技术

随着设施农业的发展，栽培面积不断扩大，氮素化肥使用量大幅度上升，大大超过植物的需求量。由于土壤中硝酸盐未能被植物及时吸收转化，造成大量盐分在植物体和土壤中积累，从而造成设施栽培土壤次生盐渍化。 

研究表明，设施栽培次生盐渍化土壤中除HCO₃^-外，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、SO₄^2-、NO₃^-均有不同程度的积累。研究表明，次生盐渍化土壤的阳离子组成中，Na⁺已不是主要离子，阳离子以Ca²⁺为主，其含量约占阳离子总量的60%以上，Mg²⁺含量在15%-20%之间；阴离子以NO₃^-和SO₄^2-为主，NO₃^-含量约为阴离子总量的56%-76%。NO₃^-可在植物体内累积，最终通过食物链进入人体，过量的NO₃^-在体内易被还原成为NO₂^-，NO₂^-可使细胞组织缺氧，严重时使人窒息死亡。因此治理设施栽培中过量的硝态氮已成为设施农业一项重要且刻不容缓的工作。目前针对我国设施栽培大棚盐渍化，采取了一些治理措施，如灌水洗盐，土壤改良剂法和半腐熟有机肥法等方法。虽然这些方法有不少优点，但也存在很大的不足：灌水洗盐会把硝态氮淋洗到地下，不仅造成土壤氮素的损失，而且还污染地下水；土壤改良剂法成本比较高，易产生二次污染；半腐熟有机肥法存在肥效慢，使用不便等缺点。 

与传统治理次生盐渍化方法相比，生物法尤其是生物酶法有许多突出优点，比如见效快、不会给周边环境带来负担。但是一般而言硝酸盐还原酶在微生物体内的表达量很低，不能满足修复环境的要求，于是构建一种高效的硝酸盐还原酶表达载体，实现硝酸盐还原酶的高效表达就显得尤为关键。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基共表达载体，克服现有技术中由于硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移共表达载体，由硝酸盐还原酶催化亚基Bm-Nas B，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，以及硝酸盐还原酶电子转移亚基Bm-Nas C，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示组成。 

所述的催化亚基和电子转移亚基的基因序列分别由2346和2151个碱基对组成。 

所述的共表达载体为包含硝酸盐还原酶催化亚基序列Bm-Nas B以及硝酸盐还原酶电子转移亚基序列Bm-Nas C的pETDuet-1质粒。 

本发明涉及上述共表达载体的构建方法，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点硝酸盐还原酶催化亚基(Bm-Nas B)和电子转移亚基(Bm-Nas C)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。 

所述的大肠杆菌DH5α的阳性克隆是指：含有重组表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C的大肠杆菌BL21(DE3)。 

本发明涉及上述大肠杆菌DH5α的阳性克隆的应用，将其发酵后修复次生盐渍化土壤。 

所述的应用进一步是指：将该共表达载体倒入大肠杆菌BL21(DE3)内，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法修复次生盐渍化土壤。