[发明专利]一种具有自生固氮、解磷和解钾能力的土壤杆菌及应用

权利要求书

1.一种具有自生固氮能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5457。

2.根据权利要求1所述的具有自生固氮能力的土壤杆菌，其特征在于该菌株具有以下特性：G^-，好氧或兼性厌氧，呈长杆状；在固体培养基A上菌落呈淡黄色，圆形凸起，边缘整齐，菌落周围有透明圈，在无氮固体培养基B上菌落呈白色，圆形，中央凹陷，边缘整齐；其最适的生长温度28~32℃，最适的pH值为6.0~8.0，其固氮酶活性为38.92~49.97nmol·mg^-1·h^-1，解无机磷能力为322.2mg/l，解钾能力为38.6 mg/l，产吲哚乙酸的能力为33.25~45.62μg/ml，产铁载体的能力为0.406~0.63，无ACC脱氨酶活性；

所述固体培养基A组成为：酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

所述的无氮固体培养基B组分为：葡萄糖 10-20 g，KH₂PO₄ 0.2 g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g，NaCl 0.15-0.25 g，CaSO₄·2H₂O 0.15- 0.25 g，CaCO₃ 5-8 g，琼脂 15-18 g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。

3.含有权利要求1所述土壤杆菌的微生物菌剂。

4.权利要求3所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种发酵

①将冻存的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，28-30℃，静置培养15-20小时，得到一级种子液；

所述的液体培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml 发酵培养基C的三角瓶中，28-30℃，130-150rpm，培养15-20小时，得到二级种子液；

所述的发酵培养基C组成为：蔗糖5-10g，淀粉2-3g，豆粕20-30g，KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52 g, CaCl₂ 0.1-0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，水1000ml，pH 7.0~7.2；

③三级发酵罐发酵

发酵罐体积10L，加入发酵培养基C 7.0 L，灭菌并冷却后，将二级培养液按照5-10%的接种量接入发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-30℃，搅拌转速为250-280rpm，通风比1:（0.4-0.6），培养48-50 小时，得菌悬液，即为固氮液体菌剂；

2）将秸秆粉、草炭土、稻糠用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30:40-60:20-30的比例混合，加入30-50%的发酵培养基C，再加入钼酸钠和硫酸亚铁，使其中钼酸钠含量为0.2~0.5g/Kg，硫酸亚铁含量为0.05~0.08g/Kg，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2-3小时，取出冷却得固态基质；

3）将菌悬液按照100-200ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28-30℃吸附发酵5-7天，达到每克菌剂中活菌数不低于10⁹CFU，包装后即得到固体固氮菌剂。

5.权利要求1 所述土壤杆菌在制备生物固氮菌肥中的应用。