[发明专利]一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它能够抑制正常生物体内特定基因的表达。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的反义链和多种核苷酸酶作用后会形成具有结合和切割mRNA作用的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC），从而最终介导RNA干扰过程。与耗时较长的基因敲除技术相比，RNAi可在较短时间内可控性地关闭多达10个基因。藉此灵活快速的特点，RNAi技术已经成为研究基因功能的重要工具，并在遗传性疾病、病毒病和肿瘤病的致病机理和治疗方面发挥重要作用。

2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)是一种复杂的代谢紊乱疾病，其发病率正随着人口老龄化，而逐年升高。2型糖尿病主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与胰腺β细胞功能发生障碍，而这主要是有遗传缺陷引起的。胰岛素受体底物(insulin receptor substrates,IRSs)蛋白处于胰岛素信号通路的枢纽位置，通过自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维持细胞正常的生理功能上起到重要的作用，IRS1和IRS2基因的缺陷是2型糖尿病发病的主要诱因。原因在于IRS1和IRS2功能的缺失会引起机体生长发育缓慢，以及对胰岛素敏感性的降低和β细胞分泌功能障碍。

在目前以小鼠为主利用转基因技术产生的2型糖尿病模型中，基本上都是具有胰岛素抵抗以及β细胞失活的特征。敲除IRS1基因的小鼠表现出生长发育缓慢以及一定的胰岛素抵抗现象，敲除IRS2基因的小鼠在出生后直接表现为胰高血糖症以及β细胞分泌功能障碍，导致生成2型糖尿病，而同时敲除IRS1和IRS2基因的小鼠出生前就会死亡。但是，小鼠模型还是具有很多局限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究目标。作为糖尿病的动物模型，小鼠对于葡糖以及胆固醇食物的反应与人类也存在较大差异。

猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等。这使得猪作为研究2型糖尿病的模式动物具有很多优点。譬如，患有2型糖尿病的猪会伴随着动脉粥样硬化，发病的解剖学位置与人类相同，而且与人类相应疾病的组织病理学特征是相似的。由于患有2型糖尿病的猪所表现出来的代谢异常与人类更加接近，因此建立有价值并且稳定的2型糖尿病猪模型是非常必要的。

发明内容

本发明提供一种抑制猪IRS2基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，主要在抑制猪源IRS2基因表达制品中应用。。

本发明还提供了一种shRNA干扰载体的制备方法，步骤如下：

（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得干扰片段；

（2）将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得干扰载体。

具体步骤如下：

（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得shRNA干扰片段；

（2）将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得干扰载体p-Genesil-shIRS2。

本发明提供的shRNA干扰载体的制备方法在抑制IRS2基因表达制品中的应用。

具体而言，对比人的IRS2基因序列和猪的基因组，根据保守区域序列设计引物，克隆猪IRS2的保守序列。

根据克隆获得猪IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段，分别合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0载体。构建并筛选的有效干扰片段为shIRS2。