[发明专利]白块菌菌根合成方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物与微生物技术交叉领域，具体地，涉及白块菌菌根合成方法，特别涉及国产白块菌与华山松菌根的合成方法。

背景技术：

块菌在国际贸易上被称为“松露（truffles）”；黑色的称为黑块菌（黑松露）；浅色的称为白块菌（白松露）。白块菌是自然界更为稀缺的生物资源，具有重大的科学研究价值和不可取代的生态价值。由于其味香特殊，价甚钻石，被誉为“舌尖上的钻石”、“上帝的食物”，而成为闻名遐迩的奇珍异馐，是块菌家族中最昂贵的类群。近10多年来国际需求强劲，价格攀升，导致掠夺性采集，自然资源量锐减，白块菌已处于极度濒危状态。

采用人为接种感染宿主植物无菌幼苗形成白块菌类菌根是目前唯一的途径，菌根合成已成为实现白块菌菌根合成及其种植中的关键核心技术。

迄今，现有技术中未见有白块菌菌根合成方法，以及白块菌与华山松菌根合成方法的报道和记载。本发明即是为解决这一技术难题而经长期探索形成的。

发明内容：

本发明的目的在于提供白块菌菌根合成方法，以及白块菌与华山松菌根合成方法。该方法涉及一系列程序与步骤，即华山松种子和块菌菌种子实体的筛选、宿主植物无菌树苗的培育、菌剂制备、育苗基质pH值的调节及其配置和优选，菌剂浓度、接种要求，菌根苗的培养与菌根形态解剖与DNA分子检测和确认，移栽种植，以最终实现人工种植白块菌，实现保护和持续利用的目的。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

白块菌与华山松菌根合成方法，包括下述步骤：

（1）华山松播种和无菌苗培育

A、种子筛选和消毒杀菌：取4-8℃冰箱内保藏不超过1年的华山松种子，30%H₂O₂浸泡2小时，无菌水冲洗数次，弃去漂浮的种子，再用无菌水浸泡48小时，捞出，用机械方式使种子轻微破口，复用75%酒精棉纱擦拭消毒，放培养皿中备用；

B、育苗基质制备：取未过筛蛭石与珍珠岩按体积比1：1混匀，加入水使其含水量达30%，121-126℃下高压蒸汽灭菌1小时；或取新生产的蛭石和珍珠岩按1：1比例混均备用；

C、播种：将（1）A步骤中备好的种子，以开口端向下的方向播入基质，播种深度为1.5-2cm，覆盖培养；

D、育苗：播种后适时无菌水浇灌；播种后第10日开始出芽，30日种子出芽大部分完成；苗龄在1.5-3月时开始接菌剂。

（2）白块菌菌剂制备和接种，

A、菌剂制备：选国产的成熟白块菌，显微镜下鉴定确认，观察到黑褐色的孢子与未成熟黄褐色孢子的比例达95:5为成熟子囊果，成熟子囊果用自来水清洗干净后，无菌水冲洗3遍，4-8℃冷藏10-20天后，再在-24℃冷冻保存不超过18个月备用。

菌剂制备前将冷冻子囊果取出，自然解冻，将每一子囊果切为数块，放置于搅拌机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检，确定95%的子囊游离，5%的孢子从子囊分离出为止，菌剂的浓度为每克子囊果/水=1g/3-5ml；

B、接种基质制备及pH值调整：腐殖质土2目过筛，适量拌入水，使水分含量30%，高压灭菌3小时后备用；腐殖质与蛭石以体积比1/1的比例混合，加入石灰粉，混匀，调整pH为7.6—8.3，备用；

C、接种：按每株接种1.2×10⁷个孢子的量折算出每株需接种的菌剂的体积，取稀释菌剂浇入基质，拌匀；将步骤（1）所得幼苗自育苗基质中取出，剪去根末端，将幼苗的根系全部浸入步骤（2）A制备的菌剂稀释液中沾取孢子后取出，植入步骤（2）B的制备的接种基质中培育；

（3）菌根苗培育：接种的幼苗置于自然通风大棚，自来水浇灌，干湿交替培养，培养温度10-26℃，每天太阳光照10-14小时。

华山松块菌菌根苗培育5-6个月后，通过形态解剖及分子水平的确认块菌菌根形成，并达到95%以上的菌根合成率，即可移植。