[发明专利]链激酶突变体及其共价修饰形式

说明书

本申请是国际申请号PCT/IN2009/000212，国际申请日2009年3月31日，进入中国国家阶段日期为2010年11月30日，中国申请号200980120111.3，发明名称为“链激酶突变体及其共价修饰形式”的分案申请。

发明领域

本发明涉及链激酶突变体及其共价修饰形式。本发明利用链激酶和其具有取代、添加、缺失的相关变体或结构域融合构建体的同质的、位点特异的和确定的PEG修饰来允许它们以改进的蛋白质治疗剂的形式应用。

本发明涉及使用硫羟反应性PEG试剂将PEG共价连接到链激酶的半胱氨酸变体、链激酶的突变蛋白、物种变体或血纤蛋白融合产物。还可以利用α胺基的不同pKa值在酸性pH下实施α胺特异性PEG缀合以产生链激酶或其突变蛋白的单-PEG化衍生物。

本发明还涉及基于结构和功能信息鉴定链激酶的多种半胱氨酸变体，或其突变体，包括相关的共价变体(Wang等，1998)。其他单结构域纤溶酶原激活物葡萄球菌激酶(SAK)的结构比较显示出与SKα结构域的强烈相似性，尽管这两种酶在氨基酸水平上没有显著的序列相似性(Rabijns等，1997)。这表明来自不同来源的纤溶酶原激活物尽管它们的多肽序列非常不同，但是仍然保留了相同的结构折叠。预期其受到进化限制来保持结构完整性，因为细菌纤溶酶原激活物是蛋白质辅因子，因此利用酶原的构象激活所需的多个接触点。此类结构相似性进一步延伸了本发明的范围，因为本案中实施的方法可以应用于来自其他属或种的具有相似的纤溶酶原激活结构域的细菌纤溶酶原激活物。为此，本文中公开的用于产生链激酶的生物活性半胱氨酸变体的“规则”将可以用于产生多种其他形式链激酶的生物活性的半胱氨酸变体。这些半胱氨酸变体与半胱氨酸反应性PEG的缀合将赋予与本研究中所用的变体所得的益处相似的益处。确定半胱氨酸放置位点的规则很大程度上基于从表面暴露的残基进行选择这一想法，所述表面暴露的残基落入环或螺旋或片层中或者在结构和柔性区的边界中。为了确定表面可及性，使用DSSP程序。DSSP(Kabsch等，1983)程序确定了蛋白质的二级结构、几何特征和溶剂暴露，以蛋白质数据库(Protein Data Bank)形式给出原子坐标。DSSP以平方埃描述每个残基的暴露。从微纤溶酶复合体中链激酶的高分辨率晶体结构译解链激酶氨基酸残基的表面可及性(Wang等1998，PDB ID1BML)。对于在该结构中缺失的区域(175-181和252-262)，分离的β结构域的晶体结构域(Wang等，1999，PDBID1c4p)用于确定表面暴露。

将链激酶的半胱氨酸变体、其突变蛋白、物种变体和其共价修饰形式通过连接巯基反应试剂进一步化学修饰，接着根据经验测试生物活性的实质性保留以及新性质的获得，所述新性质如降低的免疫原性，或者与抗SK抗体的反应、降低的蛋白水解敏感性、增加的体内存活等等。更具体地，本发明涉及生产工程化的链激酶衍生物用于治疗循环系统病症的药物组合物中。

发明背景

循环系统中血栓(血块)发展可以引起血管阻塞，导致致命的状况。凝块的产生和其溶解是高度受控的止血过程。正常止血的任何偏差都导致多种临床状况，如中风、肺栓塞、深静脉血栓形成和急性心肌梗死。止血失败所引起的病理生理学状况需要迅速的临床注意。此类病例的最常用的医学干预是静脉内施用血栓溶解剂(Collen等，1988；Collen，1990；Francis和Marder，1991)。最常用的血栓溶解剂包括链激酶(SK)、尿激酶(UK)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。在过去已经进行了急性心肌梗死处理中使用不同的溶栓剂的多种药物经济学评估(Mucklow，1995；Gillis和Goa，1996)。Banerjee等，2004，已经论述了链激酶的临床有用性和其作为选用药的适用性。就临床效果而言，链激酶和tPA几乎同样好，但是由于相差几倍的低成本和稍长的体内半寿期，链激酶是世界上最优选的溶血栓药(Sherry和Marder，1991，Wu等，1998)。而且，tPA的使用稍微更可能引起中风，其是两种药物的主要副作用。然而，链激酶是一种细菌蛋白质，本质上是抗原性的，并且可以引起临床并发症，如过敏反应或者出血。而且，链激酶的循环半寿期(15-30分钟)不足以有效溶栓(Wu等，1998)。