[发明专利]一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。

背景技术

海豚链球菌（Streptococcus iniae）为一种革兰氏阳性菌，属于链球菌属，是养殖鱼类主要病原菌之一。在我国，海豚链球菌危害的鱼类包括罗非鱼、牙鲆、美国红鱼、鲷类等。除了水生动物外，海豚链球菌还能够感染人类和其它动物，是一种典型的人畜共患病原，其感染人类后可造成各种软组织炎症以及败血症等。在我国，至今没有商业化海豚链球菌疫苗，对海豚链球菌相关病害的防治一直以抗生素和化学药物为主。

发明内容

本发明目的在于提供一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种海豚链球菌DNA疫苗,疫苗为pCNSiE。

具体为：

以海豚链球菌G26为模板经引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗；

所述引物序列为：

F1：5’-CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3；

R1：5’-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。

所述质粒pCNSiE在PBS中稀释至终浓度为150μg/ml，作为疫苗制备液。所述疫苗为注射剂。

一种海豚链球菌DNA疫苗的制备方法,以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物纯化后与用Sma I酶切的质粒pCN3连接，连接液转化到大肠杆菌DH5α后在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养18－24小时，接转化后质粒为pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗质粒。

一种海豚链球菌DNA疫苗的应用,所述质粒pCNSiE用于制备海豚链球菌的免疫疫苗中的应用。

本发明具有如下优点：

1.高保护率。本发明的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达95％。

2.长效。本发明的疫苗在免疫后两个月内的免疫保护效率没有明显减弱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

DNA疫苗质粒pCNSiE的构建：

以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,52℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,63℃60s,72℃60s,25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将质粒pCN3（pCN3构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine 2009;27:5195 202.）用Sma I酶切，回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pCNSiE。

PCR引物为F1：5’-CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3’和R1：5’-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。