[发明专利]一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程检测技术领域，具体涉及临床标本中结核分枝杆菌的荧光定量检测方法。  

背景技术

结核病(TB)是一种危害严重的慢性传染病，全球有约20亿人被感染，每年新增结核病患者达800-1000万，每年因结核病死亡人数为200-300万。我国结核病情况同样较为严峻，年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。20世纪90年代以来，结核病群或高危人群的流动或移民以及结核病控制放松及艾滋病病毒（HIV）与结核分枝杆菌双重感染蔓延等因素使结核病在全球的传播有“死灰复燃”的趋势。同时，耐药、耐多药（MDR）及超耐药（XDR）结核病占结核病比率提高，导致多种一、二线抗结核药物治疗效果下降，诊断及治疗成本上升，许多国家不同程度地出现了疫情下降缓慢或严重反弹的局面，发病率以每年1.1％的速度增长，结核病再次成为威胁人类健康的主要传染病，带来严重的公共卫生问题和重大的经济社会问题。据世界卫生组织报道,目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌,即20亿人口感染了结核杆菌,其中活动性肺结核病人约2000万 ,每年新增结核病人约800～1000万,每年约有300万人死于结核病。结核病已成为导致全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球 22个结核病高发国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病在我国流行的特点为“四高一低”：高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率和低递降率。据2000年全国结核病流行病学抽样调查估计，全国现有活动性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万。因此结核病防治是我国乃至全球疾病防治的重要课题。近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐药菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行。结核分枝杆菌的耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由于用药不当经突变选择产生（继发性耐药）。目前滥用抗生素、过渡治疗的现象很普遍，如何准确快速判断药物治疗的药效是目前急需解决的问题。临床诊断肺结核的主要依据是检测痰中结核分枝杆菌，其中，涂片法简单易行，但阳性率较低；罗氏培养法虽然是金标准，但检测周期长，均难以满足临床需要。因此提供敏感、特异、快速、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技术已成为国内外研究的重点。其中实时荧光PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床中。 

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针（TaqMan探针），目前常用的TaqMan探针5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。对于完整的TaqMan探针，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号随着目的片段的扩增而指数增长，检测每个循环结束后的荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。 

目前已有的检测方法是单独检测样本DNA或者RNA, 但还没有在同一管反应中同步检测RNA和DNA的报道。 

在前期工作基础上，本发明提出在同一管反应中同时检测RNA和DNA的方法，具体为： 

分别以结核分枝杆菌复合群的16S rRNA基因和23S rRNA基因为靶目标，对16S rRNA设计一条逆转录引物、一对PCR引物以及一条Taqman探针，对23S rDNA设计另一对PCR引物以及另一条Taqman探针，在一个反应体系中同时进行RT-qPCR（16srRNA+16s rDNA）和qPCR（23S rDNA）。分别测定总核酸（DNA+RNA）、以及DNA的绝对浓度，并算出(DNA+RNA)/DNA比值。