[发明专利]一种以五倍子单宁为原料利用发酵分离耦合技术制备没食子酸的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用液态发酵耦合膜过滤技术制备没食子酸的新方法，采用液态发酵工艺取代传统酸、碱水解工艺来完成没食子酸的制备，再采用超滤分离技术进一步纯化没食子酸，回收未发酵的五倍子单宁，进一步发酵制备没食子酸。

背景技术：

没食子酸具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌等作用，可出口创汇，深受国内外许多消费者的喜爱，有良好的发展前景。

现有制备没食子酸的工艺主要包括化学法和生物法。生物法中发酵法存在的主要问题是：生物酶的形成和单宁的水解反应周期长(3天以上)，底物五倍子单宁转化不完全，残留达15-20%。残留的底物若不除去则会影响后续没食子酸的浓缩分离。传统分离底物和没食子酸的方法为树脂吸附法，但树脂会吸附一部分没食子酸，造成产量损失，而且树脂的处理需消耗大量的酸碱试剂，会对环境造成二次污染。

目前国内制备没食子酸的原料五倍子单宁货源紧张,提高底物转化率和产品总收率，避免环境污染是急需解决的问题。

发明内容：

本发明目的在于提高底物五倍子单宁的生物转化率，解决环境污染，产量损失等问题，为工业化研究提供基础。

经过反复试验，长期研究，对传统的没食子酸生产工艺进行了创新。将传统的发酵工艺拆分成两个阶段，即生物催化剂的制备（发酵制酶）和生物转化（发酵制酸）。根据超滤膜片的物理化学性质，结合没食子酸和五倍子单宁分子量大小，将膜法分离与发酵耦合，筛选出合适的膜片，完成本发明。

一种以五倍子单宁为原料利用发酵分离耦合技术制备没食子酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：斜面培养制得单宁酶，以五倍子提取液为原料，用单宁酶进行发酵制酸；将发酵液离心或板框过滤得到没食子酸发酵清液、调pH值至中性，将发酵液超滤、浓缩、干燥、重结晶制得没食子酸。

得到没食子酸发酵清液后，没食子酸发酵清液透过0.22μm滤膜，进行预处理，在20-30℃，过滤后将清液倒入过滤装置中的原料罐进行超滤；采用恒容渗滤的工作方式，选择膜片截留分子量为1-5KDa的超滤膜，工作压力为100-300psi；循环超滤至渗透液体积为清液总体积的70-90%时，停止超滤，收集没食子酸透过液。

进一步，向原料罐中加入与透过液体积相等的去离子水，保持清液总体积不变；继续超滤，收集透过液，与之前的透过液合并，重复此过程4-8次。

此项没食子酸制备方法可以按下述步骤进行：

（1）酶种培养：配制产单宁酶菌株的种子培养基，灭菌待用。从斜面保藏培养基上挑取发酵菌种接入到种子培养基中进行培养。培养条件：温度为25-40℃，初始pH为4-7，转速为100-300rmp，培养时间为8-16h，此时细胞干重为6-12g/L。

（2）发酵制酶：配制发酵制酶培养基，灭菌待用。将培养好的种子液泵入到发酵罐中，接种体积为发酵体积的5-15%，维持发酵罐内温度在25-35℃，pH在4.0-6.0；控制通气量为1-4vvm，转速为100-250rpm，发酵18h-30h。

（3）发酵制酸：配制发酵制酸培养基灭菌待用，将发酵制酶阶段的发酵液泵入到发酵罐中，接种体积为发酵体积的5-15%，维持发酵罐内温度25-35℃，pH在4.0-6.0；在发控制通气量为1-4vvm，转速为300-500rpm，20h-40h后发酵结束；收集发酵液，离心或板框过滤，得到没食子酸发酵清液。调至pH值为中性。

（4）没食子酸与五倍子单宁的膜分离：对（3）中的发酵液进行预处理，用0.22μm滤膜过滤后，将发酵液在20-30℃恒温下，充入过滤装置。优选截留分子量为1-5KDa的超滤膜，工作压力为100-300psi，对发酵液进行恒容超滤。超滤至渗透液体积为原发酵液总体积的70-90%时，停止超滤，收集没食子酸透过液。

向原料罐中加入去离子水，保持原发酵液总体积不变，继续超滤。重复此过程4-8次后，收集原料罐里剩余的液体（未发酵的底物），重新进行发酵。

整个过程生产成本低，底物转化率从75-85%提高至93%，没食子酸总收率80-90%，比传统发酵法提高了30%，无需使用酸碱再生剂，实现了高效、无污染的目标。

附图说明

图1本发明流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施实例对本发明进行进一步的描述，但下述实例并非用来限制本发明的范围。

实施实例1.在发酵罐中制备没食子酸