[发明专利]5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对在审

专利信息
申请号: 201310553226.X 申请日: 2013-11-08
公开(公告)号: CN104630245A 公开(公告)日: 2015-05-20
发明(设计)人: 王忆平;戴雄风;朱曼璐 申请(专利权)人: 北京大学
主分类号: C12N15/54 分类号: C12N15/54
代理公司: 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人: 岑晓东
地址: 100871*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 烯醇式 丙酮 莽草 磷酸 重排 变体 互补 片段
【说明书】:

发明领域

本发明涉及5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对,及生成和使用它们的方法。

发明背景

5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是真菌、细菌、藻类、高等植物及寄生于脊椎动物上的寄生虫顶覆虫体内芳香族氨基酸合成途径(即莽草酸合成途径)中一个关键酶,它催化一分子的莽草酸-3-磷酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)。莽草酸合成途径产物除参与芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等的合成以外,还参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、吲哚衍生物、酚类物质等的次生代谢,形成的植物组分占植物干重的大约35%甚至更多。

草甘膦,即N-膦酰甲基甘氨酸,是一种广谱、高效的发芽后除草剂。草苷膦一经施用后能被植物迅速吸收,并随其同化产物传导至整个植株,阻断EPSP的合成和运输,它是EPSPS合成底物PEP的竞争性抑制剂,可阻断PEP和S3P这两种底物在EPSPS的催化下向EPSP的转化,从而阻断芳香族氨基酸的生物合成,因此对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡。

环式重排(circular permutation,CP)是一种重要的蛋白质定向进化分析的手段。蛋白质的环式重排是将蛋白质的一级序列进行重排,比如说在将一个特定位点的N端移动到这个特定位点C端的C端,即使得原来该点的C端成为了新的蛋白质变异体的N端,该点的原来的N端成为新蛋白变异体的C端。一般来说新的N端和C端之间要加一个柔韧性较好的接头,促进新蛋白质的折叠。简单来说相当于用一个接头将蛋白质原来的N端和C端相连,然后在蛋白质的内部某一个位点“剪开”,产生新的N端和C端(如图1所示)。

在自然界中已经发现了一些蛋白质环式重排变异体,产生机制一般有两种类型,分别是复制/删除机制以及分裂融合机制。对于前者来说,一个基因发生了水平串联复制,然后在N端和C端发生了任意剪切,造成了环式重排变异体的形成。对于后者来说,一个已有的蛋白的分裂产生了两个蛋白结构域或者蛋白质的片段,它们直接的重新融合产生了新的环式重排变异体。这些新的蛋白质重排变异体大多数依旧可以折叠成与天然蛋白质类似的三维结构,所以依旧拥有与天然蛋白质类似的功能。当然这些变异体一般情况下活力不如原来的母体,个别可能拥有更高的活力,但是这些变异体经常会拥有一些特殊功能,比如说对蛋白酶裂解的敏感性降低、识别更广谱的底物或者配体、更高的热稳定性,所以近年来环式重排作为一种改造蛋白质特性的手段得到了研究人员越来越多的关注。

蛋白质片段互补,1957年Richards发现,用蛋白酶裂解核糖核酸酶A后得到两个只有很少酶活性的肽链-S蛋白和S肽链,将两者混合在一起可以恢复其核糖核酸酶的活性,这被称之为蛋白重建(protein reconstitution)。后来,人们又发现许多蛋白可以由其两个或两个以上的片断成功重建,这些片断既可以由蛋白酶消化产生,也可以通过基因表达的方法生成,例如葡萄球菌的核酸酶、色氨酸抑制子等。这些可以拆分的蛋白无论大小都可能包含一个以上的能成功使蛋白重建的分拆位点,如氨酰tRNA合成酶有939个氨基酸,含有至少八个这样的分拆位点。

用于蛋白重建的片段通常包括整个结构单元或者超二级结构域。蛋白能够重建表明该蛋白至少可以在两个二级结构之间的片段区域中的共价键断开后仍旧保持一定的片段稳定性,而蛋白内的非共价作用则十分特殊,从而使片段有利于向天然的结构靠拢,却不形成其它的异变结构。在生物进化过程中,这类蛋白中使其形成天然结构的非共价作用被极大的优化,从而利于形成天然的结构元件或亚结构域。因此无论是一个完整的肽链还是两条肽链,两个没有共价键相连的亚结构域可以自发的形成天然的蛋白结构。

蛋白质的片段互补已经被用作研究结构域排列的工具,也被用作研究早期折叠中间态的模型。结合定点突变的蛋白重建可以用来评价单个氨基酸侧链对蛋白稳定性的影响,结合噬菌体展示可以确定两个片段之间起主要相互作用的位点。重建的蛋白并非一旦结合就永不分开,其片段在形成复合体和解离成单独的片段之间形成动态平衡,这种平衡的偏移方向取决于片段之间作用力的强弱。

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