[发明专利]小鼠肝脏前体细胞的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种小鼠肝脏前体细胞的生产方法。 

背景技术

在肝脏再生及发育过程中，肝脏前体细胞发挥着非常重要的作用。肝脏前体细胞（hepatoblast）具有很强的自我更新能力，同时具有向肝实质细胞和胆管上皮细胞进行双向分化的能力。它是研究肝脏发育及肝细胞分化的理想细胞来源。 

这种细胞最早出现于小鼠胚胎肝脏发育的第8.5天，是由心脏中胚层诱导产生的，这一时期它主要表达甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）。而在胚胎发育的第13.5天，这种具有双向分化功能的细胞开始向肝实质细胞和胆管上皮细胞进行分化[Jung J等人，1999；Zhao R等人，2005；Lemaigre F等人，2004]。 

截至目前，人们对肝脏前体细胞的分离进行了各种各样的研究，主要的分离方法有荧光活化细胞分选（fluorescence activated cell sorting，FACS）及磁性活化细胞分选（magnetic activated cell sorting，MACS）等方法。FACS方法主要是用通过特异性抗体识别细胞表面的分子标志物，然后通过流式细胞仪分选而得到所需要的肝脏前体细胞。目前报道的肝脏前体细胞的分子标志物主要有CD34、Thy-1、c-Kit、Dlk和E-cadherin等[Petersen BE等人，2003；Wang X等人，2003；Petersen BE等人，1998；Crosby HA等人，2001和Tanimizu N等人，2003]。FACS方法虽然特异性高，但分选步骤复杂、流程长，对细胞损伤大，严重影响细胞活力，不利于后续培养。后来人们又用到了MACS这种改良的方法来分离肝脏前体细胞。它主要是利用肝脏前体细胞的各种分子标志物蛋白的单克隆抗体作为第一抗体与单细胞悬液孵育后，再与免疫磁珠（micro-beads）标记的第二抗体结合，这种特 异性标记的细胞悬液流过特制的永久磁铁的磁场时，被吸附在磁式分选柱内，再将磁式分选柱移开磁场，从柱内洗脱，进而分离得到肝脏前体细胞。MACS需要的设备简单，能够在超净台中操作，但进行多标记分选时需要分步进行，操作步骤相对复杂，同时存在一定比例的非特异性结合，影响分离细胞的纯度。 

小鼠肝脏前体细胞是肝脏发育及肝细胞分化研究中的理想工具，需求量大、对细胞的品质要求高。因此，本领域仍需要一种操作简单、不受仪器限制、细胞产量大且分离纯度较高的改良方法来获得肝脏前体细胞。 

发明内容

根据本发明的一方面，提供一种肝脏前体细胞的生产方法，包括步骤： 

1）从小鼠胚胎中分离肝脏； 

2）获得肝脏的细胞悬液； 

3）将细胞在小鼠成纤维细胞饲养层上进行传代培养，获得单克隆； 

4）将单克隆在明胶上进行传代培养； 

5）获得肝脏前体细胞。 

在一些实施方式中，小鼠胚胎的胎龄为13至15天。在优选的实施方式中，小鼠胚胎的胎龄为13.5天（表示为E13.5），此时分离的肝脏前体细胞在饲养层上形成的克隆较大，较典型规则，同时细胞呈规则的多边形，易于挑取。 

在一些实施方式中，可以通过任何公知方法制备小鼠成纤维细胞饲养层，如方驰华等人，2010；卢海等人，2012；杨恕玲等人，2005；黄奔等人，2005中描述的方法。还可以使用市售的小鼠成纤维细胞饲养层。 

在一些实施方式中，将细胞在成纤维细胞饲养层上传代1-2次，获得细胞的单克隆。在一些实施方式中，经过饲养层培养之后，挑取细胞的单克隆接种到明胶上继续传代2-3次，收获大量的细胞单克隆。