[发明专利]胰腺癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及胰腺癌抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物以及它们抗胰腺癌的用途。

背景技术

胰腺癌是一种消化系统危害严重的恶性肿瘤。由于胰腺解剖位置特殊，症状缺乏特异性，早期诊断困难，80%的胰腺癌患者在确诊时已经是中晚期，够进行根治性手术者仅10%-15%，而且它的发病率逐年升高，在欧美居常见恶性肿瘤的第4位，在我国位于恶性肿瘤发病率的第7位。

手术切除是目前可能治愈胰腺癌的唯一手段，但仅有极少的胰腺癌患者肿瘤能获得手术切除。并且由于胰腺癌根治术后仍有极高的复发与转移发生率，即便是R0切除的患者其预后仍然很差，3年生存率仅为27% (95% 可信区间23-32%)，中位生存时间只有15-19个月。在我国死亡率位于所有恶性肿瘤的第6位。为了使胰腺癌患者根治术后能够获得长期存活，术后辅助治疗仍然是目前的研究重点之一。

近年来研究发现自体肿瘤组织中分离纯化的gp96和HSP78可以激活肿瘤特异性T细胞，起到抑制肿瘤生长的作用。热休克蛋白gp96自体免疫治疗胰腺癌的I期临床试验中位生存期达2.2年，中位无复发生存期达0.9年；治疗过程中未见严重不良事件报告。自体gp96复合物免疫治疗可以在胰腺癌术后辅助治疗中发挥作用。

gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔(Endoplasmic Reticulum)，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，而热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可增加其表达。在细胞内gp96作为分子伴侣蛋白，可阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，抑制错折叠蛋白质的分泌。gp96分子具有多肽结合的能力，能结合5-25个氨基酸的多肽序列。热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。

在细胞外，gp96可作为呈递分子将结合的短肽呈递给I类MHC分子，激活特异性和记忆性T细胞，引发机体细胞免疫反应。因此HSP本身不具备抗原性，所结合的短肽决定了复合物的抗原性。gp96还可以活化树突细胞（DC)促进MHC I类和MHC II类分子以及共刺激因子的表达，从而提高免疫反应。

目前已证实gp96和hsp78分子可以结合多种结合抗原多肽,包括泡状口炎病毒抗原区肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。但目前为止未见从胰腺癌患者肿瘤组织中分离鉴定与HSP结合的抗原多肽。

胰腺癌是严重的消化系统恶性肿瘤。前期的动物试验和I期临床试验显示，与目前的胰腺癌的标准治疗方法相比，自体gp96免疫治疗显著延长中位生存期（6月 vs 2年），具有延缓胰腺癌复发的效果。然而，由于胰腺组织特殊的解剖结构，限于这种治疗方法对肿瘤组织大小的要求和疫苗制备的一次性，能够完成有效疗程的患者有限，胰腺癌从总体上仍然不能治愈。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是筛选能激活胰腺癌特异性T细胞的肽段。克服肿瘤细胞免疫编辑导致的低免疫原性，能够在健康个体及胰腺癌患者中诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞，CTL)，而且CTL具有强大的抗胰腺癌作用，对正常细胞及组织无破坏作用。

本发明的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的胰腺癌抗原的复合物。所述的胰腺癌抗原可以分别是胰腺癌肿瘤抗原MUC1蛋白上第200-209位的氨基酸序列，其序列可以是TLVHNGTSA，或其变异序列；胰腺癌肿瘤抗原MUC1蛋白上第391-399位的氨基酸序列，其序列可以是ALLVLVCVL，或其变异序列；胰腺癌肿瘤抗原MUC1蛋白上第379-387位的氨基酸序列，其序列可以是CVLVALAIV，或其变异序列；胰腺癌肿瘤抗原MUC1蛋白上第119-207位的氨基酸序列，其序列可以是STTPPAHDV，或其变异序列；胰腺癌肿瘤抗原MUC1蛋白上第335-343位的氨基酸序列，其序列可以是AFREGTINV，或其变异序列。

本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合。本发明提供了制备本发明的如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物的方法。

本发明所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠中诱导形成特异性的CTL。

本发明所诉的表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳性胰腺癌患者PBMC分泌IFN-g，且这种作用在自体gp96免疫后显著增强。