[发明专利]一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，尤其涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时消除组织蛋白酶L影响的方法，属于水产品技术领域。

背景技术

肌球蛋白是鱼肉中含量最高也是食品加工中最重要的蛋白质，约占鱼肉总蛋白质的三分之一，占肌原纤维蛋白的55%～60%。肌球蛋白可形成具有立体网络结构的热诱导凝胶和高压诱导凝胶。肌球蛋白形成热诱导凝胶是非常重要的工艺特性，直接影响鱼糜类制品的质地、保水性和感官品质等。

溶酶体中存在多种组织蛋白酶，目前已从鱼贝类肌肉和内脏中纯化并鉴定出10种组织蛋白酶，即组织蛋白酶A、B、C、D、E、H、L、L-like及X。溶酶体组织蛋白酶L属于木瓜蛋白酶超家族，具有内肽酶活，是溶酶体型半胱氨酸蛋白内肽酶。

鱼肉肌肉内源组织蛋白酶L活性高，组织蛋白酶L的性质与鱼糜制品品质密切相关，组织蛋白酶L分子质量24ku，最适于在pH3.0～6.5环境下降解肌球蛋白。有的组织蛋白酶与肌原纤维紧密结合，仅漂洗难以洗脱鱼肉组织蛋白酶L，而其他组织蛋白酶可以从肌原纤维蛋白上洗脱下来。低pH值范围内发生的蛋白质自溶主要是由组织蛋白酶L引起的，导致凝胶形成能力差，直接影响鱼糜品质。

目前提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时的前处理通常是将鱼肉直接采肉、切丁、于冰水溶液中漂洗，再进行匀浆、提取肌球蛋白。而组织蛋白酶L主要存在于鱼肉的肝脏、溶酶体和血液中，低pH值和高温会促进溶酶体的破裂，而使溶酶体中的组织蛋白酶L释放出来，与肌球蛋白接触并使其降解。提取肌球蛋白时通常是直接采肉，就可以避免肝脏中组织蛋白酶L对肌球蛋白的影响，根据弱碱性和低温协同作用使溶酶体稳定来减少组织蛋白酶L的活性；对于血液中的组织蛋白酶L，通过快速漂洗鱼肉来减少组织蛋白酶L的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，使用该方法可以有效减小提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时组织蛋白酶L的活性，提高肌球蛋白的浓度。

本发明解决其技术问题所采用的方法包括如下步骤：

（1）活鱼放入周转箱内静置1～2 h，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气；

（2） 将活鱼放在工作台上，从活鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌，马上将采好的背侧肌置于冰水比w/v =1:5的冰水中漂洗10～20s，随即将鱼块捞出切成1～5cm×1～5cm×1～5cm鱼肉丁，此步骤时间控制在1 min 之内；

（3） 将鱼肉丁置于干净滤网上，马上用冰水比w/v=1:5的冰水冲洗1～1.5 min；

（4） 鱼肉丁于5～8倍、温度为0～4℃、pH值为7.2～7.6、20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗10～20 min；

（5）将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的缓冲溶液 A中漂洗20 min，1000×g离心5-15min；取出沉淀，放在沉淀5倍体积的缓冲溶液 B中悬浮，加ATP至终浓度为10mmol/L，2-6℃下放置0.5-1.5h，15000×g离心5-15 min；上清液用5倍体积1Mmol KHCO₃溶液稀释，放置10-20min,12000×g 离心5-15min；沉淀于5倍体积缓冲溶液 C中匀浆，放置5-15min；再用3倍体积1mmol/LKHCO₃溶液稀释，添加无水MgCl₂至浓度为10mmol/L，2-6℃下放置8-12h；25000×g离心15-25min；沉淀物用2倍体积的缓冲溶液 C溶解，得到肌球蛋白溶液；制备好的肌球蛋白溶液置于2-6℃温度下；

（6）测定肌球蛋白溶液组织蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的浓度。

所述步骤（5）中缓冲溶液A为0.1M KCl、1mM PMSF和0.02% NaN₃的20mM Tris-HCl 缓冲液，pH为7.5。

所述步骤（5）中缓冲溶液B为0.45M KCl、5mM β-巯基乙醇、0.2 M 醋酸镁、1mM 乙二醇-双-（2-氨基乙基）四乙酸的20mM Tris-HCl 缓冲液，pH为6.8。

所述步骤（5）中缓冲溶液C为0.5M KCl、5mM β-巯基乙醇的20mM Tris-HCl 缓冲液，pH为7.5。

所述步骤（1）-（5）的环境温度控制在10℃以下。

本发明的有益效果：