[发明专利]造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂

说明书

技术领域

本发明属于干细胞冷藏存储领域，特别涉及一种造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂。

背景技术

造血干细胞在临床上应用广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有－196℃液氮程控降温保存和－80℃非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。探索一种安全、简便、快速、价廉及有效的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。

在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于－80℃低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜（下称DMSO）、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80%左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂，所述保护剂的配方简单，原料便宜；该保存方法能较简便的在-80℃非程控降温的条件下保存造血干细胞，保存的细胞存活率高于90%，为临床外周血造血干细胞的储存应用及造血干细胞移植提供可靠保证。

本发明的技术方案是：造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂，所述保护剂由5体积份试剂A和2体积份试剂B组成，所述试剂A为二甲基亚砜和羟乙基淀粉溶液，其中二甲基亚砜、羟乙基淀粉的质量百分比分别为10～20%、5.4～6%，所述试剂B为白蛋白溶液，白蛋白的质量百分比为20～40%。

所述试剂A中二甲基亚砜质量百分比为10%、羟乙基淀粉的质量百分比为5.4%，试剂B中白蛋白的质量百分比为20%。

二甲基亚砜和羟乙基淀粉溶液的溶剂为生理盐水或血浆。

二甲基亚砜为细胞冻存通透性保护剂，可降低冰点并延缓细胞冷冻过程，10％的二甲基亚砜保护剂在－80℃低温中能有效保存细胞。

造血干细胞-80℃非程控降温的冻存方法，具体步骤为取上述试剂B与干细胞混匀，取干细胞+试剂B等体积的刚配好的上述的试剂A，混匀，置于-80℃冻存。

试剂B与干细胞的体积比为2:3。

试剂A的体积与试剂B和干细胞的总体积相同。

羟乙基淀粉是大分子非通透性细胞保护剂，可使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用。

白蛋白作保护剂在－80℃条件下可以保护直接冻存的造血干细胞。

采用上述技术方案，二甲基亚砜、羟乙基淀粉及白蛋白联合应用，可以有效地使干细胞冻存实现通透性保护作用，不仅降低冰点并延缓细胞冷冻过程，还增加干细胞的非通透性细胞保护作用，少细胞内冰晶形成，有效保护细胞膜，同时实现对干细胞的直接保护作用。

本发明中使用的DMSO为市售，羟乙基淀粉为医疗纯级市售，氯化钠溶液为市售，白蛋白溶液为市售，造血干细胞为临床采集，可用于造血干细胞移植的外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞和脐带血造血干细胞。

采用简便的方法对冻存细胞进行有效处理，在非程控降温的前提下，使造血干细胞的冻存及复苏过程有利于最大限度保存细胞活性，是－80℃低温保存干细胞成功的关键。本发明所述保护剂的配方简单，原料便宜；所述保存方法操作简单，在-80℃非程控降温的条件下保存造血干细胞，其保存的细胞存活率高于90%，可用于临床造血干细胞-80℃的低温短期保存。

本发明所述体积份为毫升或升。

具体实施方式

一.本发明所述造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂各试剂的用量，如表1所示：

表1

二.造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂的制备方法

1.制备试剂A:

按照实施例1-5的配比分别取100%DMSO与羟乙基淀粉氯化钠溶液，混合，装入袋中。

2.制备试剂B：

按照实施例1-5的配比配置白蛋白40ml，备用。

三.造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法