[发明专利]一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测植物病毒的试剂盒，具体涉及一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，属于植物病毒检测技术领域。

背景技术

甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）属于马铃薯Y病毒科Poacevirus属，是引起甘蔗花叶病的病原物之一。感病植株一般出现黄绿相间不规则的花纹、条斑或斑驳，长短、大小不一，布满整个叶片，尤以新叶基部症状最为明显。感病植株叶片黄化，植株矮化，分蘖减少，节间缩短，造成甘蔗产量及蔗茎含糖量降低。SCSMV主要通过植株无性繁殖材料长距离传播的，传播虫媒尚未确定。该病毒有着广泛的寄主范围，可以侵染玉米、高粱、狼尾草等植物。目前该病毒主要分布于印度、巴基斯坦、泰国、缅甸、越南、孟加拉、斯里卡兰、印尼等亚洲国家。在我国的广东、云南、海南甘蔗种质资源圃有检测到SCSMV，生产蔗区种植的甘蔗尚未发现。

为防止国外SCSMV株系随着蔗茎种苗引种入境以及在国内进一步扩散传播，为我国甘蔗脱毒种苗质量安全提供技术支撑，必需具有一种快速、可靠、灵敏的检测试剂盒及检测方法。国内外有关SCSMV检测技术主要利用血清学反应和常规的RT-PCR技术。血清学反应方法具有操作简单、高通量的优点，但需要制备高质量的血清和灵敏度不高等缺点，在实际中很难应用。常规的RT-PCR方法需要进行PCR后处理，接触溴化乙锭（EB）等有毒试剂，且只能终点定性检测，无法对病毒滴度进行准确定量。随着分子检测技术的发展，实时荧光定量RT-PCR以其高灵敏度、高特异性和高准确度等优点，被广泛应用于植物病害的检测。与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。有关检测甘蔗条纹花叶病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其方法未见报道。

本发明选择甘蔗条纹花叶病毒外壳蛋白（CP）基因保守区序列，设计用于荧光定量RT-PCR检测的引物及探针，通过对反应体系的优化，设计用于检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光RT-PCR试剂盒。

  

发明内容

本发明目的是提供一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的甘蔗条纹花叶病毒进行定量检测。该试剂盒不仅可使用于目前市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏、特异的对甘蔗条纹花叶病毒进行定量检测。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明采用Taqman探针建立荧光定量RT-PCR检测甘蔗条纹花叶病毒试剂盒，通过制备RNA标准样品与待测样品同时检测得到待测样品的初始病毒拷贝数，对病毒进行定量检测。

本发明提供了一种利用荧光定量RT-PCR方法检测甘蔗条纹花叶病毒的引物对QPCR-F1、QPCR-R1和Taqman探针QPCR-P1，所述的引物对序列如下：

QPCR-F1：5’-CGGGAAACCCATAATACCAC-3’，

QPCR-R1：5’-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’；

Taqman探针QPCR-P1的序列如下：

5’-FAM-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-TAMRA-3’。

本发明还提供一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：

（1）阳性标准品：采用T7 RNA聚合酶体外转录合成含有目的检测基因的RNA作为标准样品，1×10¹⁰拷贝/μL，50 μL/瓶，-20℃冷冻保存；

（2）阴性对照：采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总RNA为阴性对照，100 ng/μL，50 μL/瓶，-20 ℃冷冻保存备用；

（3）RT-PCR反应液：每个反应包括2×RT-PCR缓冲液10 μL、10 mmol dNTPs 0.4 μL、25 mmol MgCl₂ 1.6 μL以及浓度为10 μmol/L的引物对 QPCR-F1和QPCR-R1各0.4 μL，共12.8 μL，50个反应体系共计640 μL，-20 ℃保存备用；

（4）反应酶混合液：每个反应体系包括AMV逆转录酶液 0.4 μL、Taq酶0.4 μL，含量为5 U/μL，共0.8 μL，50个反应体系共计40 μL，-20℃保存备用；