[发明专利]甘草酸酶联免疫检测技术

说明书

技术领域

本发明涉及微量免疫检测技术领域，具体涉及甘草酸酶联免疫检测技术。

背景技术

甘草酸的检测方法主要有比色法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TCL)、毛细管电泳法(EC)等，但比色检测法易受糖类等物质的干扰，误差较大，只能测定可被显色剂显色的总皂苷类成分，色谱法固然灵敏度较高，样品的预处理程序复杂，如气相色谱需要将甘草酸转化为甘草次酸，再进行酯化，检测时间长、时效性差。此外要求操作人员技术性要求高，且需要昂贵的仪器设备，步骤繁琐，难以实时监控，在甘草及其各类制品的快速鉴定方面存在诸多不足，不能满足药用甘草真伪快速鉴定及复方药品或食品中快速大量的测定分析的需要。

发明内容

本发明的目的是提供甘草酸酶联免疫检测技术，它可对来源复杂的甘草及其相关产品进行快速、简单、准确的检测，判断甘草原料药中活性成分的有无。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它采用鼠源单克隆抗体技术，主要步骤包括：1、免疫原与包被原的合成与鉴定：采用活性酯发分别了免疫抗原和包被抗原，采用紫外扫描法检测合成抗原的性质。

2、进行动物免疫：用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通过3次加强免疫后断尾取血，血清效价均大于1∶16000，经过融合，筛选出阳性细胞株，经过三次亚克隆化后阳性率达100％，获得能稳定分泌甘草酸单克隆抗体的杂交细胞株，将其命名为3D6，经过7代培养，细胞的生长状态良好。表明该细胞稳定性良好，可以用来稳定生产甘草酸单克隆抗体。

3、制备杂交瘤细胞：取准备好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，应用间接ELISA和间接竞争ELISA方法进行筛选鉴定。阳性抑制满足要求的细胞株，进行亚克隆，获得大量杂交瘤细胞。

4、抗甘草酸单克隆抗体制备：取雌性小鼠5只，腹腔注射无菌液体石蜡0.5～1mL，7～10d后腹腔注射杂交瘤细胞1～5×106pfu/只。8～13d后待小鼠腹部明显膨大后采集腹水。待3～4d腹水再次积聚后，同法收集腹水。

5、甘草酸单克隆抗体的初步鉴定：通过间接竞争ELISA测定抗体的抑制效果，甘草酸标准品用PBS按0、1、3、9、27、81μg/L稀释成5个浓度梯度，用已建立的间接竞争ELISA所测A值计算各浓度的抑制率。

所述的动物免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。

所述的动物免疫采用体内免疫法来进行免疫，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。该方法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射。

本发明的有益效果：可对来源复杂的甘草及其相关产品进行快速、简单、准确的检测，判断甘草原料药中活性成分的有无。

具体实施方式

本具体实施方式采用以下技术方案：它采用鼠源单克隆抗体技术，主要步骤包括：1、免疫原与包被原的合成与鉴定：采用活性酯发分别了免疫抗原和包被抗原，采用紫外扫描法检测合成抗原的性质。

2、进行动物免疫：用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通过3次加强免疫后断尾取血，血清效价均大于1∶16000，经过融合，筛选出阳性细胞株，经过三次亚克隆化后阳性率达100％，获得能稳定分泌甘草酸单克隆抗体的杂交细胞株，将其命名为3D6，经过7代培养，细胞的生长状态良好。表明该细胞稳定性良好，可以用来稳定生产甘草酸单克隆抗体。

3、制备杂交瘤细胞：取准备好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，应用间接ELISA和间接竞争ELISA方法进行筛选鉴定。阳性抑制满足要求的细胞株，进行亚克隆，获得大量杂交瘤细胞。

4、抗甘草酸单克隆抗体制备：取雌性小鼠5只，腹腔注射无菌液体石蜡0.5～1mL，7～10d后腹腔注射杂交瘤细胞1～5×106pfu/只。8～13d后待小鼠腹部明显膨大后采集腹水。待3～4d腹水再次积聚后，同法收集腹水。

5、甘草酸单克隆抗体的初步鉴定：通过间接竞争ELISA测定抗体的抑制效果，甘草酸标准品用PBS按0、1、3、9、27、81μg/L稀释成5个浓度梯度，用已建立的间接竞争ELISA所测A值计算各浓度的抑制率。

所述的动物免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。