[发明专利]西洋参发状根诱导及植株再生研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，属于作物生物技术领域。

背景技术

西洋参(Panax quinque folium L.)American Ginseng，是我国传统名贵药材，它属于五加科人参属多年生草本植物，又称为美国参、花旗参、洋参、广东参等名字，它最早是产于北美的原始森林，现在主产于法国、加拿大及美国，生长的最佳环境是在海拔2000公尺左右的丘陵地带，并且属于海洋性气候，大概分布于北纬30°～47°、西经67°～125°的大森林中。从20世纪80年代起我国就成功地大面积引种西洋参，经过几十年的努力，我国已经发展成为继美国、加拿大之后的世界第三大西洋参生产的国家和世界最大的消费国家。

西洋参不论是地下还是及地上部分都含有多种生理活性成分，其中包括西洋参皂甙，它主要是三萜类化合物，与人参皂甙结构基本相似。其它成分还包括黄酮类、挥发油、蛋白质、、肽类、氨基酸、淄醇类、维生素、多糖、微量元素、核酸等。西洋参中最主要的有效成分是西洋参皂甙，它也是西洋参中生理活性最显著的物质，为此人们对西洋参皂苷进行了大量的研究，先后从中分离出20多种单体皂苷。近十几年来许多学者开始关注西洋参多糖的免疫功能。

西洋参为我国传统珍贵的药用植物，广泛的应用在人类保健和医疗上，并且市场对其需求量逐渐增加。由于西洋参对土壤条件要求十分严格且容易受气候及病虫害的影响，所以生产成本高、资源破坏严重，而且其生长周期特别长，以至于西洋参产量偏低，经济效益不好。因此要寻找一条有效的途径改善西洋参的产量和质量，提高其生产效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，以便更好地解决植株再生面临的根的分化难，或者生长能力弱和形成的根数量少难题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，包括以下步骤：

(1)外植体处理：(I)西洋参种子萌发及处理：经过沙藏层积处理，已经裂口的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种1～2周苗长出后，用0.1％升汞消毒6min，无菌水清洗4～5次。将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的起始材料。(II)西洋参一年、二年生根的处理：将西洋参一年、二年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3～4h，用0.1％升汞消毒10min～20min后，无菌水洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用。

(2)菌种保存、活化及培养：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌菌种溶于甘油中，于-20℃条件下保存，这种方法可以保存菌种几年。短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4℃冰箱中保存，此种方法可以保存菌种数月。

无菌条件下，用接种针挑取保存的菌液，于YEB固体平板上划线，28℃置于黑暗条件下培养，直到长出明显的单菌落。然后挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r/min、28℃、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出。取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中，120r/min，28℃暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期时，此时的菌液就可以作为感染用。

(3)西洋参发状根诱导条件的优化：

(3a)不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响：选择发根农杆菌R1601、8196、A4、rolA四个菌种经平板活化培养后接入YEB液体培养基中，待其菌液生长浓度达到OD₆₀₀=0.6时用于侵染用。2～3周苗龄的西洋参实生苗，选择生长良好幼嫩的，将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，在无25±1℃摇床100～120r/min侵染10～30min，无菌条件下取出。灭菌滤纸吸干材料表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响。

(3b)菌液浓度对西洋参发状根诱导率的影响：制备好的R1601菌液用YEB液稀释至OD₆₀₀值为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，将西洋参实生苗外植体投入不同浓度的菌液中浸染15～30min，25±1℃摇床100～120r/min，然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液，在共培养基上培养2d后，再转接到MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基。