[发明专利]一种下调微小RNA-126表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学领域，尤其是一种下调微小RNA-126表达的方法。 

背景技术

微小RNA-126（microRNA-126，miR-126）具有重要的生物学作用。目前，改变miR-126的表达，从而研究其生物学功能的技术主要有慢病毒载体表达的miR-126海绵体（Sponge）、反义核酸（Antisense oligonucleotides，ASO）、抑制剂（Inhibitor）和Antagomir等。然而，这些方法存在作用时间短、稳定性差、构建复杂、仪器条件要求高且技术操作复杂的不足，难以达到方便、简单而有效地下调miR-126表达的效果。 

发明内容

本发明的目的是：提供一种下调微小RNA-126表达的方法，它方法设计简单，操作容易，能简单而有效地下调miR-126表达的效果，以克服现有技术的不足。 

本发明是这样实现的：下调微小RNA-126表达的方法，在含CMV启动子的真核载体上构建靶向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126-sponge，以下调miR-126在真核细胞中的表达；并将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-126成熟体的表达，同时通过体外实验观察下调miR-126表达后的生物学效应。

所述的pEGFP-C2-miR-126-sponge的构建，具体是，利用软件完成miR-126-sponge的序列设计；再用HindⅢ/KpnI 双酶切骨架载体pEGFP-C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段纯化，在16℃的条件下过夜连接；连接后转化，挑取6个菌落，接种到含10μg/ml卡那霉素的LB培养基中，12小时后提取菌液和质粒小抽法抽提质粒，并通过引物实现目的片段的PCR扩增，扩增目的片的引物序列为：上游，5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；下游，5’-GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’； 重组质粒经HindⅢ和KpnI双酶切后，成功构建重组质粒pEGFP-C2-miR-126-sponge。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明利用分子生物学技术，在含CMV启动子的真核载体基础上，构建含miR-126-sponge的真核表达载体，实现下调miR-126的表达；并通过将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-126成熟体的表达，同时通过体外实验观察下调miR-126表达后的生物学效应。这样的方法不仅可以方便、快速、长效地下调miR-126的表达，同时还可快捷地观察miR-126下调表达后的生物学效应。不仅适于细胞的转染，也可用于整体水平转基因动物的制作。

附图说明：

图1为本发明的实施例的miR-126-sponge序列的设计原理图；

图2为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体构建示意图；

图中：MCS, 多克隆位点（Multiple clone sites）；SV40，猴空泡病毒40（Simian virus 40）；EGFP，增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein）；Kanr，卡那霉素抗性（Kanamycin resistance）；HSV，单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus )；Puc Ori, 复制起始位点（origin of replication）; Pcmv，人巨细胞病毒启动子（Human cytomegalovirus promoter）；

图3为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体构建过程中的克隆菌液PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳；

图3中，1-6代表小量抽提的重组质粒，M代表电泳marker；

图4为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体构建过程中的重组质粒PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳；

图4中，1-6代表小量抽提的重组质粒，M代表电泳marker。

图5为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体构建过程中的重组质粒双酶切；

图5中，1为未酶切重组质粒，2为HindⅢ和KpnI双酶切重组质粒，M代表电泳marker；

图6为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-sponge真核表达载体构建过程中的重组质粒测序结果；