[发明专利]表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学领域，特别是一种新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法。本发明所用病毒株为新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，缩写NDRV)安徽太湖11株。 

背景技术

鸭出血性坏死性肝炎是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)引起的各种品种鸭的一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病。不同品种鸭均易感，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，以5～10日龄居多，病程5～7d，发病率5％～20％、死亡率2％～15％。 

2005年以来，四川、广东、安徽等省份陆续报道鸭群中出现一种新的病毒病，威胁着水禽养殖业的健康发展，后经鉴定病原为新型鸭呼肠孤病毒。NDRV宿主相对ARV和MDRV要广泛，自然状态下对各种品种鸭(番鸭、半番鸭、北京鸭、麻鸭)均有致病性，人工感染亦可引起SPF鸡的发病甚至死亡，给水禽养殖业带来了一定得威胁。与其他禽源呼肠孤病毒相似，该病毒基因组由分节段的10个基因片段组成。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：NDRV外衣壳蛋白σB和σC均为抗原蛋白，能刺激机体产生保护性中和抗体，σB为群特异性抗原，σC为型特异性抗原，而通过纯化病毒得到的抗原蛋白十分有限，且原核表达无法对蛋白表达修饰加工，表达产物与天然蛋白有一定得差距，故有必要运用真核表达系统对该病毒蛋白在体外进行高效重组表达，进而为制备NDRV基因工程疫苗及开展抗病毒机理研究丌辟新的有效途径。 

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案： 

本发明提供了高效双表达NDRVA外衣壳蛋白σB和σC的重组病毒vAcNDRV-σB／σC。 

本发明还提供了上述重组病毒AcNDRV-σB／σC的构建方法，具体是：通过RT-PCR扩增，分别得到2条编码NDRV外衣壳蛋白σB和σC基因的特异片段，通过克隆筛选获得了插入NDRV外衣壳蛋白σB和σC基因的重组pPastBacDual双表达载体pFbDNDRVσB／σC；将筛选得到的重组双表达载体转化DH10Bac细胞，得到转座的AcNDRV-σB／σC Bacmid；将AcNDRV-σB／σC Bacmid转染sf9昆虫细胞，在sf9中获得重组病毒vAcNDRV-σB／σC。 

所述方法具体为： 

①用于扩增NDRV-σB／σC蛋白基因的新型鸭呼肠孤病毒毒株为NDRV TH11株。 

②以NDRV TH11基因组dsRNA S1和S3片段为模板，采用RT-PCR方法扩增NDRV σC和σB基因片段，S1和S3； 

③扩增的NDRVσB和σC DNA片段与pFastBacDual双表达载体连接，获得重组质粒pFbDNDRVσB／σC； 

④将筛选得到的重组质粒转化DH10Bac细胞，获得转座的AcNDRV-σB／σC Bacmid； 

⑤采用cellfectin脂质体，将纯化的AcNDRV-σB／σC Bacmid转染sf9昆虫细胞，获得在sf9昆虫细胞中高效表达的重组病毒AcNDRV-σB／σC。 

具体而言， 

(1)根据NDRVσB和σC基因的GenBank序列以及pFastBacDual供体质粒的多克隆位点设计含酶切位点的引物，NDRVσB和σC基因的GenBank序列分别为JX826588和JX826587. 

(2)采用逆转录酶系统与高保真Taq酶，进行σB和σC编码基因片段的RT-PCR扩增； 

(3)将σC基因插入到pFastBacDual多角体启动子下游，σB基因插入到P10启动子下游。 

本发明可采用以下的引物扩增NDRV σB和σC编码基因序列 

(1)用于扩增NDRV σB的引物序列是： 

上游引物σB-F：TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT(SEQ ID NO.1) 

下游引物σB-R：GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG(SEQ ID NO.2) 

(2)用于扩增NDRV σC基因的引物序列是： 

上游引物σC-F：CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID NO.3) 

下游引物σC-R：GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ ID NO.4)