[发明专利]流产嗜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种流产嗜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

衣原体是介于细菌和病毒之间的一类微生物，在微生物分类中单独列目的一属球形、专性细胞内寄生的微生物。衣原体在分类学上属于原核细胞界、薄壁菌门、纲未定（衣原体与立克次氏体并列）、衣原体目、衣原体科。衣原体科又分为衣原体属和亲衣原体属，嗜性衣原体属包含嗜衣原体属，包括流产嗜衣原体(Ch. abortus)、豚鼠嗜衣原体（Ch. caviae）、猫嗜衣原体(Ch. felis)、家畜嗜衣原体(Ch. pecorum)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, CPn)和鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)。它可以感染各种年龄的猪均能感染，但是临床上的表现是有所不同的。Ch. abortus主要引起反刍动物的流产，是全球性引起绵羊、山羊流产和经济损失的重要病原。本病除了引起绵羊、牛、山羊和猪流产和胎儿损失外，也能够引起与流产畜群接触人的流产。Ch. abortus主要寄生于猪、牛、羊等多种动物生殖道黏膜表面的上皮细胞,造成生殖道黏膜受损,导致以母畜流产、死胎、弱胎,公畜睾丸炎、尿道炎、龟头炎、包皮炎等为特征的慢性接触性传染病。由此可见流产嗜衣原体对畜牧业的危害，对人也存在一定的危害，因此对于本病的防控就显得尤为重要。荧光定量PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、较高的稳定性。而TaqMan-MGB是一种新型的探针，3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。本文建立了针对TaqMan-MGB探针的优点，通过对猪衣原体特异保守序列进行设计探针，建立了高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5^，末端，淬灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3^，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5^，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

     TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。

中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan—MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测流产嗜衣原体的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种流产嗜衣原体TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物用于流产嗜衣原体TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒进行肉食品出入境检测的检测方法。

为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：本检测用引物包括流产嗜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1;流产嗜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；流产嗜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案：一种流产嗜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：