[发明专利]用于检测NQO1基因多态性的引物、试剂盒及其在病理检测上的应用

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及用于醌氧化还原酶1基因NQO1*2(C609T)、NQO1*3(C465T)位点多态性检测的引物、试剂盒和在病理检测上的应用，采用焦磷酸测序技术，能对醌氧化还原酶1基因多态性进行检测，特异性好，准确度高。

背景技术

醌氧化还原酶1基因（NADPH：quinone oxidore-ductase1，NQO1）是由Ernster和Navazio于1958年首先报道的，最初被称为DT-硫辛酰胺脱氢酶(DT-diaphorase)。它是绝大多数真核生物细胞中普遍存在的一种黄素蛋白酶,能够解除许多天然和合成化合物的毒性,同时又能活化一些醌类抗肿瘤药物,因而引起了广泛关注。NQO1是一种可诱导的还原酶,酚类抗氧化剂、多环芳烃、偶氮染料、缺氧等外界环境因素均可以强烈地诱导NQO1表达。这种可诱导性表达使得NQO1可能在肿瘤预防和肿瘤治疗上起重要作用。

20世纪90年代初，有研究发现NQO1cDNA609位点上存在C/T单核苷酸多态性(SNP)，可能改变酶的二级结构，使酶的活性降低，增加了氧自由基的生成。目前发现人的NQO1基因序列中，引起蛋白质编码氨基酸序列改变的非同义编码单核苷酸多态性有三个，其中包括位于第四外显子的C465T和第六外显子的C609T，分别引起所编码的139位氨基酸由色氨酸（Trp）变为精氨酸（Arg），187位氨基酸由脯氨酸（Pro）变为丝氨酸（Ser）。这些氨基酸序列改变，可能导致了个体中酶NQO1活性的降低或缺失，减弱了NQO1对醌类化合物的解毒作用及改变肿瘤对特定原癌基因及抑癌基因功能的影响，从而使机体患肿瘤的可能性增加。

研究发现，酶NQO1具有2个野生型等位基因即野生纯合子(C/C)的个体，NQO1酶的活力正常；而具有杂合子(C/T)的个体酶的活力降低，具有突变纯合子(T/T)的个体NQO1酶的活力则完全消失。

目前对于NQO1C465T研究尚不很多。NQO1cDNA465位点上存在C/T单核苷酸多态性。不同人群NQO1465T等位基因频率较低(0～0.05)。许多研究还发现，NQO1C609T基因多态性频率在种族分布上有很大差异，基因型为(T/T)的纯合子个体在中国和其他亚洲人种为18%～20%，大约为高加索人和美籍非洲人的4倍。

鉴于NQO1与肿瘤的发生、发展密切相关，其第六位外显子（C609T）和第四位外显子（C465T）具有非同义编码单核苷酸多态性，可引起蛋白质编码的碱基序列改变从而导致蛋白质功能的改变，进而影响肿瘤的发生发展。对其进行检测将有助于进一步明确其遗传背景在肿瘤发生中的作用，并为肿瘤个体化治疗提供有益的指导。

在临床实验室中，目前检醌氧化还原酶1基因NQO1*2(C609T)、NQO1*3(C465T)多态性的常用方法为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RELP）法。该技术为第一代DNA分子标记技术，利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生特征性的限制性片段，该方法的缺陷在于检测灵敏度低且只能检测大概型别，不能具体到突变比例。

本发明在原有的基础上进行焦磷酸测序检测，不仅能检测到多态性位点的具体突变情况，也能根据图谱辨别出突变比例，使检测结果更加具体化。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明除了利用两对特异性的引物分别对醌氧化还原酶1基因NQO1的第四外显子C465T位点片段和第六外显子C609T位点片段进行常规PCR扩增外，还利用一对焦磷酸测序引物对PCR扩增片段进行正向测序和反向测序，不仅能够检测到多态性位点的具体突变情况，也能根据测序图谱辨别出突变比例，使检测结果更加具体化，从而能够更好地为肿瘤个体化治疗提供有益的指导。