[发明专利]一种生产中低温β-甘露聚糖酶的菌株及其应用

权利要求书

1.一种生产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OPUS-001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7361。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌OPUS-001在中低温井水力压裂破胶中的应用。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌OPUS-001用于发酵制备中低温井水力压裂破胶用β-甘露聚糖酶。

4.一种β-甘露聚糖酶的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌OPUS-001菌种接种于瓜尔胶固体培养基上，30-37℃、培养1-2天；

（2）将固体培养基单菌落接于种子培养基内，30-37℃、震荡培养1-2天，成为种子液；

（3）将种子液接入发酵培养基中，30-37℃、培养2-5天，离心，得发酵液；

（4）发酵液经分离纯化，得β-甘露聚糖酶；

其中所述瓜尔胶固体培养基为：琼脂粉20g/L，瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，补水至1L，pH7.0-8.0；所述种子培养基为：瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO4.7H₂O 0.2g/L,L-谷氨酸 5.0g/L，KCl 0.5g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H²O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH7.0-8.0；所述发酵培养基为：瓜尔胶 2-4g/L，酵母浸粉 5g/L，NaNO₃ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H₂O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH7.0-8.0。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（2）中所述震荡速率为150-200rpm/min。

6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）中种子液与发酵培养基的体积比为1:20-50。

7.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）所述的分离纯化包括如下步骤：

①将发酵液离心，取上清液滤去残渣得粗提液；

②粗提液中加入的饱和硫酸铵，经放置沉淀后离心，取上清液；上清液加入饱和硫酸铵，经放置沉淀后离心，得沉淀；沉淀溶于PBS，透析得到透析酶液；

③步骤（2）的透析酶液经Sepharose G-75柱层析分离，获得β-甘露聚糖酶洗脱峰组份，超滤膜浓缩，得液状β-甘露聚糖酶。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，在步骤③得到的液状β-甘露聚糖酶冷冻干燥，得粉状β-甘露聚糖酶。

9.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，步骤②中所述的饱和硫酸铵浓度为45-65%；粗提液与饱和硫酸铵的体积比为1:10，上清液与饱和硫酸铵的体积比为0.5:1。