[发明专利]一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备

权利要求书

1.一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，是超氧化歧化酶（SOD）分子上的自由氨基与季铵化壳聚糖（TMC）分子的氨基通过二硫键结合，一分子超氧化歧化酶（SOD）与1～20分子铵化壳聚糖（TMC）结合，结构式如下：

-SOD-S-S-(TMC)n；

式中，n=1～20；SOD的分子量为32000Da；TMC的分子量为2000Da及以上，自由氨基摩尔含量为5%～80%。

2.如权利要求1所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述n=1～6，即一分子超氧化歧化酶与1～6分子季铵化壳聚糖共价结合形成修饰物；季铵化壳聚糖的分子量为5000Da～100000Da，自由氨基摩尔含量为15%～50%。

3.一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）称取季铵化壳聚糖（TMC）溶于10mM PBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，加入3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP），使季铵化壳聚糖中自由氨基与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为（1～100）∶1，震荡反应，除去未反应的3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得TMC功能化产物；

（2）将超氧化歧化酶溶于10mM PBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，，制得超氧化歧化酶溶液，加入3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP），使超氧化歧化酶与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1∶（0.1～50），震荡反应，除去未反应的3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得活化的SOD；

（3）取步骤（1）制得的TMC功能化产物，加入二硫苏糖醇（DTT）水溶液，室温震荡反应，除去过量的二硫苏糖醇和中间产物，得到巯基活化的TMC（TMC-SH），然后，加入步骤（2）制得的活化的SOD，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为（0.5～20）∶1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，，0～60℃保温反应1h～48h，经纯化后，制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。

4.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤（1）中的季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖的浓度为3mg/ml～20mg/ml，季铵化壳聚糖中自由氨基与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为（4～12）∶1。

5.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的震荡反应的温度为室温，反应时间为1h。

6.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中除去未反应的SPDP和中间产物的方法为凝胶过滤柱层析或膜分离技术。

7.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤（2）中的超氧化歧化酶溶液中超氧化歧化酶的浓度为0.5mg/ml～5mg/ml，超氧化歧化酶与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1∶（1～15）。

8.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤（3）中的二硫苏糖醇（DTT）按摩尔量计为步骤（1）中季铵化壳聚糖中自由氨基的1～5倍；进一步优选的，所述步骤（3）中TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为（1～10）∶1；

9.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤（3）中的室温震荡反应时间为30min；除去过量的二硫苏糖醇和中间产物的方法为凝胶过滤柱层析或膜分离技术；

进一步优选的，所述步骤（3）中的保温反应温度为30℃～40℃，时间为10h～20h；所述的纯化为采用弱阴离子交换柱层析纯化。

10.一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

（1）称取季铵化壳聚糖（TMC）50mg溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，TMC的浓度为5.0mg/ml；加入3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）3.5mg，室温反应1h，采用1.6cm×50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，制得TMC功能化产物；

（2）将超氧化歧化酶（SOD）溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，超氧化歧化酶的浓度为1mg/ml（0.03125μmol/ml）；将30μl SPDP溶液加入到超氧化歧化酶溶液中，温室下震荡反应1h；采用1.6cm×50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，制得活化的SOD；

（3）取步骤（1）制得的含TMC功能化产物50mg的溶液，加入25mg二硫苏糖醇，室温震荡反应30min，采用1.6cm×50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，得到巯基活化的TMC（TMC-SH），加入步骤（2）制得的活化的SOD，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为3∶1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，40℃保温反应16h，产物经DEAE Sepharose FF离子交换柱层析纯化，于10mM PBS缓冲液中以0至1.0M NaCl线性梯度洗脱，收集样品峰制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。