[发明专利]检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒及其使用方法

背景技术

据估计全球约有10%的育龄夫妇不育，其中男性因素引起的生殖障碍约占一半，而因遗传性因素引发男性不育的比例为30%，其中发病率最高的两种是克氏综合症和Y染色体微缺失，有10～15%的无精症或少精症存在Y染色体的微缺失。

Y染色体是最短的近端着丝粒染色体，是男性特有的染色体，Y染色体上有多个基因参与生精过程，研究表明，Y染色体上存在一个关键的与生育相关的因子的区域，称为无精子因子（azoospermiafactor，AZF），目前认为在AZF上存在三个精子发生亚区（AZFa、AZFb、AZFc），各亚区包含的位点在男性生殖细胞发育不同时期起着不同的作用，位点的缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从而引发不育，而在AZFb于AZFc之间还存在AZFd座位，中等程度的少精子和精子数目正常却形态异常多与该区域的缺失有关。AZFa缺失的患者，主要表现为支持细胞综合症伴睾丸体积缩小，无精子生成；AZFb缺失的患者，主要表现为生精过程阻滞在精母细胞阶段，无精子生成；AZFc缺失的患者表现多样化，会出现无精子症和少精子症的不同临床表现。对于Y染色体微缺失的原因，普遍认为染色体内的非同源重组是该突变的主要机制。Y染色体微缺失一般在染色体核型分析不易发现，目前主要通过AZF区域的序列标签位点（Sequence tagged sites,STSs）来诊断，根据欧洲男科协会建议的六个STS位点进行Y染色体微缺失的分析，即：AZFa(SY84、SY86)，AZFb(SY127、SY134)，AZFc(SY254、SY255)，对上述位点的分析，Y染色体微缺失的检测准确率可以达到95%。

当前，Y染色体微缺失检测的主要方法是通过PCR特异性扩增Y染色体AZF区域的序列标签位点（STS），再用电泳或Southern blot杂交等方法检测PCR扩增产物，但电泳灵敏度低、准确性不高，杂交操作繁琐、耗时耗力、成本高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测Y染色体微缺失的引物，本发明还公开了包括有该引物的试剂盒及其使用方法。

本申请的发明人根据6个STS位点和内参基因设计特异性引物，通过多重PCR扩增结合DHPLC（变性高效液相色谱分析）检测，可以快速、准确地检测Y染色体微缺失。

根据本发明的实施例，提供了一种用于检测Y染色体微缺失的引物，所述引物包括8对引物，可同时扩增Y染色体上6个基因位点和两个内参基因；

所述Y染色体上6个基因位点为：SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255位点；所述两个内参基因为：SRY和TP53基因；

特异性扩增SY84位点的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

SEQ ID NO:15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’

SEQ ID NO:25’-GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’

特异性扩增SY86位点的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，

SEQ ID NO:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’

SEQ ID NO:45’-ACACACAAGGCGAACCCCT-3’

特异性扩增SY127位点的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，

SEQ ID NO:55’-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’

SEQ ID NO:65’-CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’

特异性扩增SY134位点的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，

SEQ ID NO:75’-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’

SEQ ID NO:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’

特异性扩增SY254位点的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，

SEQ ID NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’

SEQ ID NO:105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’