[发明专利]脑膜炎奈瑟氏菌Z群的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中脑膜炎奈瑟菌Z群核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。利用本发明的序列组合或试剂盒，可快速检测样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏菌Z群核酸。该试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌Z群的检测限为200拷贝每反应体系。整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏菌（N.meningitidis）是流行性脑脊髓膜炎的病原菌。人类是脑膜炎奈瑟菌的唯一宿主。本菌可定植在人类鼻咽部的粘膜上，称为携带状态，在健康成人和儿童中本菌的携带率可达5%-15%。本菌借飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰，被感染者多为青少年和婴幼儿。感染后多数患者呈携带状态或隐性感染，少数出现上呼吸道感染症状，极少数发展成败血症，进而累及脑、脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜炎，严重者可迅速出现休克和散播性血管内凝血，或频繁痉挛惊厥，进而昏迷，不及时救治病死率极高。脑膜炎奈瑟菌有13种血清群，我国流行的血清群以A群为主，其次为C群，其他血清群如B、Y、W135、Z和X在我国仅有散发的病例报导。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。此外，对于已知的致流行性脑脊髓膜炎病原菌的检测，发现有一些非A群也导致流行性爆发的能力，如Z群脑膜炎奈瑟菌。实际检测过程中，对于一例待测样品，可检测其中是否有Z群脑膜炎奈瑟菌。

本发明分别针对脑膜炎奈瑟氏菌Z群特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来快速检测样品中是否存在Z群脑膜炎奈瑟氏菌核酸。

发明内容

为了快速准确地检测样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏菌Z群。本发明提供一种特异性检测样品中脑膜炎奈瑟氏菌Z群核酸的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为：

P1：5`- TCGCTATGGTTACGGCATGTAG-3`, 

P2：5`- CAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAA-3`；

P1和P2为针对脑膜炎奈瑟氏菌Z群基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。

本发明的的特征还在于， 序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为：

Probe1：5`-X<sub>1</sub>- CCTCCGGCCCTAGTGCGAAAAA-Y<sub>1</sub> -3`；

X₁，Y₁为荧光淬灭基团。Probe1为针对脑膜炎奈瑟氏菌Z群基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。

本发明的一优选实施方案为：序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的包含上述一对特异性引物和一条特异性探针，属于单重实时荧光PCR检测，可在同一个反应体系中对脑膜炎奈瑟氏菌Z群核酸进行检测。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min; 进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

本发明的另一优选实施方案，试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10 μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5 μl、10μmol/L 探针0.2 μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA 2μl，加灭菌水至终体系20 μl。

本发明提供的试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌Z群核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系。

本发明提供的试剂盒可以检出脑膜炎奈瑟氏菌Z群，但不能检出非脑膜炎奈瑟氏菌Z群病原体的核酸，说明试剂盒具有很好的特异性。