[发明专利]哈茨木霉厚垣孢子的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及哈茨木霉厚垣孢子的生产方法。

背景技术

木霉菌（Trichoderma spp.）属真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落。木霉属真菌广泛分布于自然界，广泛存在于腐木、种籽、植物残体、空气中，可从中分离得到。

木霉菌具有重要的经济意义，被广泛地应用到农业的各个方面，如防治植物病害、促进植物生长、生物修复土壤和环境、应用于生物有机肥等。近些年，木霉菌的研究与应用得到了快速发展。结合遗传学、分子生物学、生物化学及生态学等研究方法，木霉菌及其代谢产物在促进植物生长，增加营养物质的吸收利用率，提高农作物的产量，以及增强对病害的防御性方面有着广阔的应用前景。特别是在倡导绿色农业的背景下，木霉菌的大面积推广应用已成为构建现代和高效的生物防治病虫害体系中不可或缺的一部分。

随着社会的进步，人们越来越深刻地认识到长期大量使用化学农药对生态环境和人类健康的危害。生物防治可以有效地克服这些弊端,因而生物农药逐渐受到人们的重视。其中拮抗微生物在植病生防中的应用倍受人们关注。在2013年已发现的拮抗微生物中，木霉菌具有很好的生防活性。

木霉属中应用最多的是哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。目前，木霉真菌应用于农业方面大都是采用分生孢子制剂，但分生孢子制剂存在自身的缺陷。分生孢子货架期比较短，一般只有2到3个月左右，夏季更短，而且分生孢子抗逆能力低，这不利于哈茨木霉应用于农业方面。厚垣孢子具有耐干燥、耐低温、存活期长等优点，可使孢子易于加工和贮存，有利于在土壤中存活。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产哈茨木霉厚垣孢子的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种哈茨木霉厚垣孢子的生产方法，包括哈茨木霉菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备以及固体发酵的步骤。

其中，用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基，包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3-4.5、豆粕粉0.75-1.5和无机盐离子溶液4-6.25。其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵0.5%-2%、氯化钠0.01%-1.5%、磷酸二氢钾0.1%-1.5%、硫酸镁0.1%-1.5%、硫酸锰0.1%-1.5%、硫酸亚铁0.01%-0.1%、蛋白胨0.05%-1.5%、葡萄糖0.05%-1.5%，余量为水。

优选地，用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基，包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3.4-4.2、豆粕粉0.85-1.2和无机盐离子溶液4.2-5.8。其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵0.7%-1.5%、氯化钠0.5%-1.2%、磷酸二氢钾0.3%-0.9%、硫酸镁0.2%-1.2%、硫酸锰0.2%-1.2%、硫酸亚铁0.04%-0.08%、蛋白胨0.2%-1.2%、葡萄糖0.5%-1.2%，余量为水。

更优选地，用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基，包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3.6、豆粕粉1和无机盐离子溶液5.4。其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵1.2%、氯化钠1%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁1%、硫酸锰1%、硫酸亚铁0.05%、蛋白胨1%、葡萄糖1%，余量为水。

固体发酵的方法为：将二级液体种子液按10%-15%（优选15%）的接种量接种至上述用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基中，于25℃-35℃，通气量2.5L/min，相对湿度保持在80%以上的条件下，进行暗培养10-15天，每隔2-3天翻动1次培养基。

前述方法中，一级液体种子液的制备方法为：将活化后的哈茨木霉接种于斜面种子液体活化培养基中，于28℃发酵培养4天，即得一级液体种子液。其中，所述斜面种子液体活化培养基中各成分的质量百分数为：硫酸铵1.5%、葡萄糖1.2%和吐温800.2%，余量为水。

前述方法中，二级液体种子液的制备方法为：将一级液体种子液按9%的接种量接种至哈茨木霉的液体发酵培养基中，于30℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，pH值6.0的条件下，发酵培养3天，即得二级液体种子液。其中，哈茨木霉的液体发酵培养基的配方为：麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L和泡敌0.3g/L，以水配制。