[发明专利]对转染后的siRNA进行初步筛选的简易方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生化实验方法，具体来说，对转染后的siRNA进行初步筛选的简易方法。 

背景技术

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快捷，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。 

发明内容

为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案： 

对转染后的siRNA进行初步筛选的简易方法，首先在细胞培养皿中接种所需数目六倍的PK细胞，所述PK细胞为处于生长期的PK15细胞；然后将上述细胞浸入融合剂中，进行完全培养，保持温度始终保持在35摄氏度；24小时后进行转染；转染前，将转染剂加入至培养皿中，混合振荡，弃清；随后按比例，将siRNA与血清加入至培养皿中，混合均匀5分钟；转染10小时；高速离心；加入预凉的异丙醇，上下翻转混匀即可。

本发明中，引物工作液需要在离心前加入，并且事先需要在零下八十度的条件下保存。 

本发明中，高速离心后需要用枪头敲打，洗涤沉淀物。 

本发明的有益效果是，可以有效鉴定PCR，同时效果明显，表达清楚、稳定，为下一步能够成功建立模型奠定坚实基础。 

具体实施方式

对转染后的siRNA进行初步筛选的简易方法，首先在细胞培养皿中接种所需数目六倍的PK细胞，所述PK细胞为处于生长期的PK15细胞；然后将上述细胞浸入融合剂中，进行完全培养，保持温度始终保持在35摄氏度；24小时后进行转染；转染前，将转染剂加入至培养皿中，混合振荡，弃清；随后按比例，将siRNA与血清加入至培养皿中，混合均匀5分钟；转染10小时；高速离心；加入预凉的异丙醇，上下翻转混匀即可。引物工作液需要在离心前加入，并且事先需要在零下八十度的条件下保存。高速离心后需要用枪头敲打，洗涤沉淀物。 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。