[发明专利]一种猪圆环病毒2型的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器细胞培养技术生产疫苗的方法，可用于工业化生产猪圆环病毒2型疫苗，替代传统的转瓶培养法生产工艺。

背景技术

目前，猪圆环病毒2型灭活疫苗生产国内主要都采用细胞转瓶培养方法实现，该传统工艺生产半成品抗原效价低，难以达到配苗要求，需要进行劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；不同生产批次间或同一生产批次不同瓶间的差异大；难以扩大生产；容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有细胞转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器细胞微载体悬浮培养技术生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种猪圆环病毒2型的生产方法，是选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择pK-15A1#细胞作为制苗用细胞；

(1)、制苗用细胞的传代与接种

将致密单层的pK-15A1#细胞经消化液消化分散后取样计数，用含10%NBCS的MEM生长液将pK-15A1#细胞调整为2-3×10⁵个/ml，再接种到生物反应器上进行培养；所述培养条件为：温度为37.0℃（±0.2℃），pH值为7.40，DO为40%-80%，转速为40rpm-80rpm；

(2)、制苗用细胞的接毒

将在生物反应器中培养的pK-15A1#细胞按照体积比1%-5%接种PCV2病毒，接毒后按照所述培养条件继续培养；

(3)、接毒后的培养

接毒后在细胞培养12h时补加200μmol/L的必需氨基酸；在细胞培养约24h时更换含10%NBCS的MEM生长液一次；在细胞培养48h时，细胞长满微载体50%-60%，吸出MEM生长液后，用预热的无菌PBS洗涤两次，再加入含2%NBCS和1%D-氨基葡萄糖的MEM维持液继续培养；

（4）、病毒的收获与效价检测

维持液培养后约54h后停止搅拌，静置5min后吸出上清作为一收，此后加入MEM维持液继续培养48h，静置后吸出上清，收获为二收，此后加入MEM维持液继续培养48h，此时将微载体和培养液一起全部收获，冻融三次后作为抗原保存。

上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L-3000L。

上述技术方案中，微载体微载体，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：

1）用PBS浸泡微载体2小时以上；

2）用PBS清洗微载体3遍；

3）用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。

上述技术方案中，胰酶消化液配方为：质量分数分别是0.25%的胰酶（1：250）消化液；细胞生长液的配方为：MEM的体积比例为88%，NBCS的比例为10%，双抗的比例为1%，L-Glutamin的比例为1%。

上述技术方案中，种毒接种量为1-5%，病毒培养液配方为：含血清1-2%的MEM液、加适量的双抗，pH调整为7.2-7.4。培养温度为37.0±0.2）℃。

上述技术方案中，生物反应器设定参数为：培养温度培养温度33-38℃、pH6.5-7.68、溶氧30%-70%、搅拌速度40-80rpm。

健康细胞的接毒采用细胞同步接毒工艺，细胞同步接毒工艺为：

（1）采用无支原体和PCV2/PCV1污染的pK-15A1#细胞作为制苗用细胞；

（2）细胞接种到微载体上的密度为2-3×10⁵个/ml；

（3）细胞在生物反应器上培养的条件为：温度：37.0℃（±0.2℃），pH值：7.40，DO：40%-80%，转速为40rpm-80rpm；

（4）细胞接毒按照1%-5%（体积比）接种PCV2种毒，接毒后按照之前既定的培养条件继续培养；

（5）在细胞培养12h时应酌情补加200μmol/L的必须氨基酸；在细胞培养约24h时应换细胞培养用生长液一次；