[发明专利]检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物和方法

说明书

本申请是申请号为201210331289.6、申请日2012年9月10日的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对DHFR（C829T）多态性位点进行检测。

背景技术

骨髓抑制限制了多种化疗药物的应用，使之难以达到治愈或抑制肿瘤生长的效果，而一些耐药基因是产生骨髓抑制的分子基础，如二氢叶酸还原酶基因

(dihydrofolate reductase，DHFR)。

DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，分子量为22KD。在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的参与下，DHFR能催化叶酸变成二氢叶酸，而后者为合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷输送了碳元素，因此DHFR是DNA、RNA及蛋白质等物质合成的其中一种关键酶。此外，DHFR也是抗代谢类抗肿瘤药物氨甲嘌呤（MTX）的靶酶。MTX是一种叶酸类似物，在临床上常用来治疗乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多种肿瘤。其作用原理是通过竞争性与DHFR的活性位点紧密结合而使其失活，从而导致细胞中四氢叶酸含量下降，细胞DNA合成异常，造成细胞死亡。但是在治疗过程中一些肿瘤细胞很快对其产生耐药性，骨髓抑制的毒副作用也较严重、限制了其疗效。

DHFR基因的SNP是导致肿瘤细胞对MTX产生耐药的一种因素。虽然MTX 可以竞争性地抑制DHFR，但是当MTX和DHFR亲和力下降时，MTX抑制该酶的作用就会明显下降。诸多研究表明在一些耐药细胞中，由于DHFR基因中第829号核苷酸会发生T代替C的突变，即产生CC型（野生纯合型）、CT型（杂合型）、TT 型（突变纯合型）三种基因型，而后两者导致了DHFR蛋白质结构的改变，进而影响DHFR与MTX结合的空间结构，最终引起DHFR和MTX亲和力的下降，提高了细胞的抗药性。吴瑞琼等将含突变mDHFR的逆转录病毒上清转染脐血 CD34+细胞之后进行细胞抗MTX分析，结果发现转导mDHFR耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组，同时对MTX的抗性提高了约2倍。另有资 料显示将转导有人的突变mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后，再使用大剂量MTX治疗，结果表明转导有突变mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大剂量化 疗的冲击治疗，并使44％的小鼠肿瘤完全消退，而对照组小鼠全部死亡。终上所述，正是由于DHFR中一个氨基酸的改变从而使细胞具有对MTX的耐受性。

因此，检测肿瘤患者中DHFR（C829T）的基因型，有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案，获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，可用于检测DHFR(C829T)位点是否发生突变。

一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：

PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO.1、SEQ NO .2，其序列为：

SEQ NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，

SEQ NO.2：Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；

测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO.3，其序列为：

SEQ NO.3：AGTCCCCAGCACCTG。

进一步地，所述PCR试剂包括2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/μl  Taq 酶、特异性扩增引物SEQ NO.1和SEQ NO .2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%（V/V）乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。

所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

（1）提取样本中的DNA

（2）以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物（SEQ NO.1、SEQ NO.2）进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；

（4）将步骤（3）得到的单链纯化产物进行测序；

（5）结果分析。

进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃ 2min预变性；98℃ 10s、58℃ 30s、68℃ 30s，40个循环；68℃ 5min。