[发明专利]检测MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性的引物和方法

说明书

本申请是申请号为201210290751.2、申请日2012年8月15日的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对MDR1（G2677T/A）多态性位点进行检测。

背景技术

多药耐药基因1（multidrug resistance gene1，MDR1）位于人类染色体7q21.1～21.12，基因全长约209kb。MDRl21外显子上的错义突变G2677T/A造成基因产物的氨基酸发生变化，丙氨酸（Ala）转变为丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr），使得该基因的表达和功能发生改变。MDRl的G2677T/A的多态性包括了以下6种：GG型（野生纯合型）、GT型（杂合型）、GA型（杂合型）、AT型（突变杂合型）、TT型（突变纯合型）、AA型（突变纯合型）。

多药耐药（MDR）是导致肿瘤化疗失败及多种疾病预后差的重要原因之一，而P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）机制是多药耐药的主要原因之一。P-gp是1个由MDR1基因编码的分子量为170kD的细胞膜糖蛋白，具有广泛的作用底物，P-gp一旦与抗肿瘤药物结合,便通过ATP提供能量，将药物从胞内泵出胞外，同时P-gp还能增加小肠壁对药物的排除从而造成耐药。G2677T/A的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与P-gp活性的关系最为密切，且诸多研究表明G2677T/A影响了包括化疗药物、免疫抑制剂等许多药物的药代谢动力学，并与许多恶性肿瘤的发生、预后相关。于庆忠等在研究肺癌患者MDR1G2677T/A与铂类化疗疗效的相关性时发现，携带至少1个T等位基因的患者的化疗有效率2.8%要显著低于其他基因型患者的58.1%；Kmi等对急性髓细胞性白血病患者的研究发现，G2677G的白血病患者的完全缓解率要明显高于携带其他基因型的患者；Kurata等在研究中发现G2677GG个体服用单剂量地高辛后,血清药物浓度低于G2677GT或者是G2677TT个体；唐惠林等的研究表明，在844例肾病患者中，GG基因型患者的CsA剂量调整谷浓度明显低于其他基因型患者，同时GG基因型患者的给药后2h剂量调整浓度及平均日剂量与(TT+TA+AA)基因型患者之间有显著差异。因此，了解患者及不同人群中G2677T/A基因型情况，有助于临床医生更好地针对个体或群体的差异制定相关治疗方案和选择合适的药物及剂量。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种检测MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性的试剂盒，可用于检测MDR1（G2677T/A）位点是否发生突变。

一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：

PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO1、SEQ NO2，其序列为：

SEQ NO1：GCAATAGCAGGAGTTGTTGAA，

SEQ NO2：Biotin-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG；

测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO3，其序列为：

SEQ NO3：GATAAGAAAGAACTAGAAGG。

进一步地，所述PCR试剂包括2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/ul Taq酶、特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%（V/V）乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。

所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

（1）提取样本中的DNA

（2）以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物（SEQ NO1、SEQ NO2）进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；

（4）将步骤（3）得到的单链纯化产物进行测序；

（5）结果分析。

进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃2min预变性；98℃10s、58℃30s、68℃30s，38个循环；68℃5min。