[发明专利]一种rPoIFNα1的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及药用干扰素蛋白的纯化，特别适用于工程菌发酵得到的带his-tag标记基因工程重组干扰素规模化生产过程中的蛋白质分离纯化。

背景技术

干扰素（interferon，IFN）是由病毒或其他干扰素诱导剂刺激机体后产生的一种小分子量糖蛋白，具有广谱地抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等功能，根据来源等不同，可分IFN-α，IFN-β，IFN-γ三种。其中IFN-α可刺激机体产生抗病毒蛋白质，且具有广谱的抗病毒作用。重组人IFN-α已广泛用于临床，治疗各种病毒性疾病，其疗效已被各国学者所公认，但动物干扰素的临床应用却相对缓慢。

我国是世界上养猪大国，猪的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高，每年给养猪业造成巨大的经济损失，有些病毒性疾病还威胁到人类健康。因此具有良好抗病毒作用的重组猪干扰素，不仅对我国养猪业的健康发展有重要意义，也为人类的生命健康提供了重要保障。

本课题组采用基因工程原核表达技术，已成功构建出可高效、稳定表达具有高活性rPoIFNα1的E.coli BL21工程菌（重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804），具有工艺流程短、生产成本低等优点。应用此工程菌进行高密度发酵后的纯化目的蛋白是一道非常重要的工艺过程：即将rPoIFNα1从复杂的细菌表达环境中提取出来，去除各种杂质，包括颗粒、细菌、内毒素、核酸和各种杂蛋白等非目标蛋白物，以达到政府药品监督管理部门对该种生物制品要求的各项质量标准，才能满足临床需求。

目前国内外有一些对重组猪干扰素分离纯化报道，但其重组猪干扰素制备工艺各不相同，因此生产过程中蛋白质纯化工艺也完全不同。中国专利（CN 101570757A）构建的猪α干扰素/白细胞介素2融合蛋白是以包涵体形式表达，采用包涵体变性复性的方法初步纯化猪α干扰素/白细胞介素2融合蛋白，该纯化工艺尚达不到生物制品生产要求；中国专利（CN 102732587A）采用真核载体构建表达重组猪干扰素α，该工艺生产周期较长，规模化生产成本高。因此探索建立本课题构建的rPoIFNα1蛋白规模化生产分离纯化工艺，具有重要的理论意义和实践价值。

目前，利用重组工程菌株表达生产级用生物制品，在后期的分离纯化过程中一般都要使用价值昂贵的单克隆抗体亲和层析纯化柱，纯度才能达到95%以上。而本室自行构建的工程菌所表达的rPoIFNα1，市场上并无对应的单克隆抗体亲和层析纯化柱可供用于纯化。因此，自行建立一种经济、快速和高效的纯化方法，以得到高纯度的rPoIFNα1，尤为重要。

本发明采用了包括镍离子螯合层析、强阳离子交换层析、强阴离子交换层析三步层析方法，大幅度地提高了rPoIFNα1的纯度（纯度高达98.8%）。

发明内容

本发明目的就是为了提供一种rPoIFNα1的分离纯化方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种rPoIFNα1的分离纯化方法，包括以下步骤：

（1）金属螯合层析；

（2）强阳离子交换层析；

（3）强阴离子交换层析。

所述的金属螯合层析为镍离子螯合层析，平衡液是含5~45mM咪唑的磷酸盐缓冲液；

强阳离子交换层析所用纯化柱是SP Sepharose FF，平衡液是pH4.0~6.0的醋酸盐缓冲液；

阴离子交换层析所用纯化柱是Q Sepharose FF，平衡液是含0~25mM氯化钠的缓冲液。

本发明的优点是：

使用本发明提供的纯化方法，得到的rPoIFNα1蛋白纯度高达98.8%，达到生物制品注射用重组干扰素质量标准要求，适合规模化生产用。

附图说明

图1 rPoIFNα1蛋白层析纯化色谱图;

图1 A: rPoIFNα1蛋白亲和层析色谱图，其中纵坐标mAu表示A280紫外吸收值，横坐标为体积;

图1 B: rPoIFNα1蛋白阳离子交换层析色谱图，其中纵坐标mAu表示A280紫外吸收值，横坐标为体积;

图1 C: rPoIFNα1蛋白阴离子交换层析色谱图，其中纵坐标mAu表示A280紫外吸收值，横坐标为体积;

图2rPoIFNα1纯化蛋白Western blot 检测结果

M：蛋白质分子量Marker；

泳道1：rPoIFNα1蛋白纯化后结果；

泳道2：rPoIFNα1蛋白纯化前对照；

泳道3：BL21工程菌蛋白对照。