[发明专利]一种直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药与化工领域，具体涉及一种携带标记蛋白的重组猪α干扰素聚乙二醇偶联物的制备方法，以及其在制备用于兽用抗病毒药物中的用途。 

背景技术

PEG（聚乙二醇）是一种中性、水溶性、无毒性的聚合物。它是少数几个被FDA批准的可用于体表和体内的聚合物，在食品、化妆品、个人保健和医药行业广泛应用。PEG的特性是由其溶于水中的行为所揭示，在水溶液中长链的PEG分子，具有高水合性（即水分子结合到它表面）。PEG的重要特性是可以附着到其他分子和表面上，提供了一个生物相溶的、保护性外壳。这种保护性外壳降低了生物系统中（如人体）这些材料的清除，极大的降低了蛋白质、细胞和细菌的吸附，降低了肾脏的清除率。PEG在水和许多有机溶剂中可溶，在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成双相系统。在乙醚和碳水化合物如己烷中不溶。双功能PEG的水溶性、无毒性、高柔性和特征明确的化学特性，使它成为理想的修饰蛋白类产品的交联材料。PEG与干扰素的偶联已广泛应用于用于临床。如先灵葆雅公司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2β（商品名，佩乐能，PegIntron）；罗氏公司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2α（商品名，派罗先，PegasyS）等。已经证实被偶联后的干扰素，生物学活性大部分得以保留，同时免疫应答极大地降低，血清半衰期也极大地得到了延长。 

动物α型干扰素对畜禽病毒性疾病具有较好的防治效果。安徽医科大学微生物学教研室王明丽教授课题组采用基因工程技术克隆并表达了猪α型干扰素，并将实验室合格产品制成冻干粉针剂发送至安徽省多家养猪场进行临床试验。结果证明，该室研制的重组猪α干扰素能有效治疗猪犬病毒性疾病。对治疗猪病毒性腹泻有效率为83.5%，治愈率为63.9%（中国发明专利CN101289666Α）。这一项目在产业化进程中。在该项目的基础上，对重组猪α干扰素进行聚乙二醇化修饰，以获得长效制剂，从而延长药物在体内循环半衰期、减少体内清除率，减少给药次数、降低动物的应激性、增强疗效、降低用药成本。作为新型兽药的开发这一项目有重要的学术价值和应用前景，同时具有较高的社会效益和经济效益。 

发明内容

本发明目的就是为提供一种一种直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物、制备方法及其应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物，它具有如下结构式： 

式中，mPEG为聚乙二醇链，Protein为N端携带标记蛋白重组猪α干扰素（TRX-HIS-Interferon）。 

一种直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物，所述的干扰素是N端携带标记蛋白重组猪干扰素（TRX-HIS-Interferon,Mw=39KD）。 

一种直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物，所述的聚乙二醇部分是分子量为2-30KD的直链聚乙二醇。 

一种直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物的制备方法，包括以下步骤： 

（1）将干扰素用5mM pH3.0-5.0的磷酸二氢钾缓冲液稀释到0.1mg/ml； 

（2）加入计算量的干扰素，用NaOH溶液调节pH值到8.0，冰浴保存，按干扰素：mPEG为1:20的物质的量加入1/4量的mPEG-SC，在0-4℃条件下反应，随后每间隔2h加入1/4量的mPEG-SC，加入完毕后继续反应4-8h，所述的mPEG-SC有如下结构： 

（3）加入0.75Μ的甘氨酸终止反应； 

（4）取上述反应液少许，通过SDS-PAGE计算反应率，随后进行纯化，所述的纯化包括以下步骤： 

（1）将上述反应液用5-10倍量体积、浓度为50mM pH7.2的醋酸钠缓冲液 稀释，然后将稀释液上羧甲基纤维素柱（Waterman CM-52），以5倍体积pH7.2的醋酸钠缓冲液洗柱后，用含0.5M NaCl的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含PEG-干扰素的洗脱液，浓缩； 

（2）用Superdex200对（1）中得到PEG-干扰素进一步纯化，洗脱液为pH7.2的醋酸钠缓冲液（含0.2M NaCl），收集含PEG-干扰素的洗脱液，浓缩。 

直链聚乙二醇-重组猪α干扰素偶联物，该药物可以用在制备兽用抗病毒药物中。 

本发明的优点是：