[发明专利]具抗肿瘤作用的海蚯蚓蛋白酶cDNA的克隆与表达

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域：涉及到海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其相应的氨基酸序列及在大肠杆菌中的表达，及其抑制肿瘤细胞的增殖，发挥抗肿瘤作用。

背景技术

蛋白酶是一类分布于动物、植物和微生物中能够特异水解肽键的水解酶，其中部分为丝氨酸内切蛋白酶，这些蛋白酶在生物体发挥不同的生理作用，如凝集、纤溶、消化、免疫、调节胚胎发育等。近年来的实验及临床研究表明，一些蛋白酶能抑制肿瘤细胞生长，并且作为生物反应调节剂，具有辐射增效和化学增效等作用。蛋白酶具有抗肿瘤效应，其潜在的医用前景，引起了科学界的广泛关注。

海蚯蚓是我国海岸广泛分布的一种海洋环节动物，常被用作钓饵。海蚯蚓最早记载于《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒，有清热解毒之功效。目前国内外有关海蚯蚓的研究报道不多。我们从海蚯蚓消化道组织中提取出总RNA，经RACE技术得到一种编码蛋白质的cDNA，将此cDNA序列中活性肽部分构建入质粒pET-21a，转化入大肠杆菌，诱导表达出一种重组蛋白，此蛋白质中含丝氨酸内切蛋白酶家族的保守序列GDSGGP，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

以来自海蚯蚓消化道上皮细胞的mRNA为模板，采用同源序列克隆法，通过3′RACE、5′RACE技术，获得了一种编码具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。将该序列表达活性肽的部分经PCR扩增，克隆到表达载体pET-21a上，在原核表达系统大肠杆菌E.coli BL21中诱导表达，生产具有抗肿瘤活性的重组海蚯蚓蛋白酶。重组海蚯蚓蛋白酶具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，可作为潜在的新型基因工程药物。

海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆：

（1）设计引物：根据丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP设计引物。

（2）目的基因cDNA 3′端序列扩增及测序：由步骤（1）得到引物，和来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，通过3′RACE（cDNA3′末端快速扩增技术）扩增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3′端序列。 PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

（3）目的基因cDNA 5′端序列扩增及测序：根据获得的目的基因cDNA 3′端序列设计两对特异性引物，以来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，采用5′RACE（cDNA 5′末端快速扩增技术），进行套式PCR，扩增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5′端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

（4）拼接：应用contigexpress软件对步骤（2）和（3）得到的目的基因cDNA 3′端和5′端序列进行拼接，获得本发明的海蚯蚓蛋白编码基因的DNA（mRNA）序列。

（5）根据上述步骤（4）得到的DNA（mRNA）序列，使用DNAMAN软件，获得该海蚯蚓蛋白酶cDNA编码的氨基酸序列。

一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列，该序列如下：

1        AATATGAATT CAGGCCCTAA CACAATTCTA TCATGATGTT TCTGGTGGTT GCTGCCTTGG

61       TGGCAACTGC TGTTGCAGCC CCAAGAGATC GTCTGACACC ACCTGTTCCA ACTTTGATTA

121      CTGAGAAGGA TTCCTACATT ATTGGTGGTT CTGATGCATC CGCTGGCCAG TTCCCCTTCA

181      TTGGCTCCCT GCTGTCTTCC ACTAGCTCTG GAGGCAGCCA CACTTGTGGT GCTGTGAGGA

241      TCAGTTCTAC CTGGGTTCTC TGTGCTGCTC ACTGCACACA GTCAAGCTCC CGCAGTGTAT

301      GGTTTGGAAT CCGTTGCCGT AGCTCCACCA GTGGAGGACA GCACAGGTCC TTTAGCCGTA